廖忠意（贵州警官职业学院 司法鉴定中心，贵州 贵阳 550005）

对腐败血液DNA三种提取方法的比较

廖忠意（贵州警官职业学院 司法鉴定中心，贵州 贵阳 550005）

对新鲜的血液或者血痕，采用直接扩增和chelex-100直接处理提取DNA，一般都能获得完整、均衡的DNA分型，但在日常检案过程中，陈旧血痕、载体潮湿、委托方送检的样本由于保存不当导致血液和少量血痕检材腐败的情况也比较常见。这类检材DNA采用普通的chelex-100直接提取很难获得比较完整的DNA分型。结合一列检案，分别用chelex-100、磁珠法、微量DNA提取试剂盒三种方法专门针对腐败血液进行比较分析。

chelex-100；磁珠法；微量DNA提取试剂盒；纯化柱

一、材料与方法

（一）材料

取自本实验室检验的亲子鉴定一案例中腐败血液一份。

（二）主要仪器与试剂

9700型PCR扩增仪（美国ABI公司），3500遗传分析仪（美国ABI公司），案件专用磁珠法DNA提取试剂盒（长春市博坤生物科技有限公司），Simgen微量DNA提取试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司），Goldeneye20A试剂盒（北京基点认知技术有限公司）。

（三）DNA提取

1. chelex-100

分别取100μL、200μL血液置0.5ml离心管中，加入300μL超纯水浸泡10min，适当振荡；13000rpm离心3min，去上清液，用超纯水重复洗涤2次，最后仅剩50μL液体。剩余液体中加入chelex-100100μL、蛋白酶K10μL，56℃育2h，适当振荡，100℃8min，13000rpm离心3min，上清用于PCR扩增和检验。

2. 磁珠法

分别取100μL、200μL血液置1.5ml离心管中，加入300μL超纯水浸泡10min，适当振荡，13000rpm离心3min，去上清液，用超纯水重复洗涤2次，最后仅剩50μL液体。剩余液体中加入150μL裂解液，漩涡振荡混匀后，95℃温育30min后漩涡振荡混匀，加入10μL磁珠，漩涡振荡混匀，室温吸附10min，吸附后液体漩涡振荡混匀立即将离心管放于磁力架上，磁吸10秒，然后吸弃所有液体再加150μL裂解液洗涤1次，配置的洗涤液洗涤3次，放置在磁力架上室温5min，加25μL超纯水，65℃溶解5min，置磁力架上，磁吸10秒，上清转移另一管中备用。

3. Simgen微量DNA提取试剂盒

分别取100μL、200μL血液置1.5ml离心管中，加入300μL超纯水浸泡10min，适当振荡；13000rpm离心3min，去上清液，用超纯水重复洗涤2次，最后仅剩50μL液体。剩余液体中加入180μLBufferAT、20μL蛋白酶K，漩涡振荡混匀，金属浴56℃，900rpm温育1h，加入5μLCarrierRNA和250μL BufferSL，漩涡振荡混匀，金属浴70℃，900rpm温育10min，14000rpm离心1min，吸取上清到另一个1.5ml离心管中，加入320无水乙醇，混匀后加入到核酸纯化柱中，12000rpm离心30秒，分别用BufferWA和BufferWB洗涤一次，加25μLBufferTE洗脱DNA。

4. SRT分型检测按Goldeneye20A试剂盒说明书操作进行扩增，扩增产物在3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，用GeneMapper·ID-X软件进行基因分析。

二、结果

chelex-100、磁珠法、Simgen微量DNA提取试剂盒分别提取100μL的血液样本没有得到STR分型，图如下：

图1　chelex-100提取100μL血液STR分型图谱：

图2　磁珠法提取100μL血液STR分型图谱

图3　Simgen微量DNA提取试剂盒提取100μL血液STR分型图谱

从图1～3可以看出血液样本腐败严重，大部分DNA都被降解掉，只有增加提取样本量，从腐败的样本里获得更多的DNA片段，从而才能扩增出目标基因片段，得到完整的STR分型。

增加样本到200μL用chelex-100、磁珠法、Simgen微量DNA提取试剂盒分别提取得到STR分型图谱如下：

图4　chelex-100提取200μL血液STR分型图谱

图5　磁珠法提取200μL血液STR分型图谱

图6　Simgen微量DNA提取试剂盒提取200μL血液STR分型图谱

三、讨论

用chelex-100法对不同体积的血液样本都没有获得可分析的DNA分型；磁珠法提取得到的DNA分型由于峰值太低，杂峰较多，导致多个分型不正确；用Simgen微量DNA提取试剂盒得到的DNA分型比较完整，检出全部基因座，除D19S433有杂峰和D12S391有拔起峰外，其他基因座的都比较干净平衡。

腐败血液中的DNA随着时间的延长将持续地被降解，片段变得越来越小，DNA浓度也会持续降低，同时由于腐败所产生的PCR抑制物则会持续增加。要获取可分析的DNA分型，需要满足以下两个条件：1.高效地回收降解成小片段的DNA；2.高效地去除PCR抑制物。［1］

不同的DNA提取方法所产生差异可能的原因如下：

1. chelex-100法无法去除腐败血液中的PCR抑制物，目标片段无法扩增，无法获得DNA分型。［2］

2. 磁珠法更适合浓度高、长片段DNA的分离纯化，对于小片段、低浓度的DNA回收率较低，并且磁珠法与纯化柱相比较，其去除PCR抑制物的效率也更差一些，因为磁珠聚集在一起的时候非常紧密，在磁珠间隙之间的抑制物常常清除不干净，而过柱法的滤网膜是稳定的网状结构，抑制物可以有效地被清洗掉。

3. DNA浓度低于ng级别时，无论是磁珠法还是过柱法，DNA的回收效率都会大大降低。

DNA浓度低时，DNA和介质的结合几率就会降低，只有尽可能地让目标DNA结合到磁珠或者硅胶膜介质上才有可能提取到更多的DNA。两种介质相比较，过滤柱的网格则比单点的磁珠有天然的优势。单点的磁珠与DNA的结合是点对点的结合，而过滤柱则是一个平面筛网，可以尽可能的兜住DNA。［3］

4. 在解决了介质的问题后，还需要提高目标DNA和介质的结合效率，同时减少在去除盐和蛋白的过程中DNA的损失。

在DNA提取的过程中，当DNA因为客观原因已经降解成小片段而必须改善提取方法，添加CarrierRNA已经被证实是有效手段之一。CarrierRNA是片段在200-3000nt之间的RNA混合物，溶解于RNA保护剂中。CarrierRNA在核酸的提取过程中造成了鱼群效应，原本可能会穿过硅胶膜的小片段DNA由于硅胶膜已经结合了大量的CarrierRNA，堵住了小片段DNA的通道，更加拥挤的核酸群更容易被硅胶膜捕获。同样，在除盐和除蛋白的时候，CarrierRNA同样承担了被冲走和损失的份额。由于CarrierRNA的这种特点并且不影响下游的PCR扩增检测，在柱纯化微量核酸的过程中（比如病毒RNA纯化、病毒DNA纯化及微量DNA提取等），CarrierRNA的应用非常广泛。在柱纯化核酸纯化体系中添加CarrierRNA，可提高10倍以上微量核酸的回收效率。

四、结论

笔者实验结果证实有效改善提取方法可以有效提取腐败血液中的DNA。腐败血液、陈旧血痕、微量样本是法医微量DNA检验中经常遇到的样本，是否能提取到足量后续检验使用的DNA及清除PCR抑制物是影响检验结果的关键本次实验检材是送检的亲子鉴定检材，使用的时候样本量较容易控制，而在临场的时候提取的检材腐败程度，掺杂砂石、细菌霉菌滋生等要比本次实验复杂得多。因此在案件侦破中应及时尽早的提取样本。

分子生物学技术在医学和植物研究领域已经获得了巨大突破，而在刑侦检测方面的进展却比其他领域要慢。由于各自领域的封闭性和我国国情的特殊性，只有打破这种行业之间的壁垒，开展跨领域合作才可以更好地将最新的分子生物学技术引进到刑侦领域。只有获得更为先进的提取检验方法，才可以在获取的血斑、血痕等重要检材中，充分挖掘出其利用价值。

［1］刘淑芳，吕晓革，王英元.高度腐败组织不同DNA提取方法的比较［J］.中国法医学杂志，2006（6）：408.［2］郑秀芬.法医DNA分析［M］.北京：中国人民公安大学出版社，2002（5）：15.

［3］胡平，聂胜杰，刘建兴，等.3种提取高腐败检材DNA的方法比较［J］.中国法医学杂志，2006（5）：299.

责任编辑：安国江

Comparisons of Three DNA Extraction Methods Applied to Decayed Blood

LIAO Zhong-yi
（Forensic Center， Guizhou Police Officer Vocational College， Guiyang 550005， China）

Usually， complete and balanced DNA typing can be extracted from fresh blood or bloodstains through direct amplification and chelex-100 . In case of daily inspection process， however， such circumstances are quiet common， like old blood stains， moist carriers， decayed blood and small amount of decayed bloodstain samples caused by improper preservation. For such samples， it is hard to extract complete DNA typing through the method of chelex-100. Combined with a case， this paper compares and analyses three DNA extraction methods applied to decayed blood： chelex-100，paramagnetic particle method and trace DNA extraction kit.

chelex-100； paramagnetic particle method ； trace DNA extraction kit ； purification column

D918.2

A

1671-5195（2016）04-0059-04］

10.13310/j.cnki.gzjy.2016.04.008

2016-01-29

廖忠意 （1985- ），男，贵州贵阳人，贵州警官职业学院司法鉴定中心法医。