王翠， 何玲， 罗聪， 冯川， 刘先凡



·分子影像学·

油酸钠、壳聚糖和葡聚糖修饰的超顺磁性Fe3O4纳米粒作为MRI对比剂的实验研究

王翠， 何玲， 罗聪， 冯川， 刘先凡

目的：观察油酸钠、壳聚糖和葡聚糖分别修饰的超顺磁性Fe3O4纳米微粒(SPIONs)的物理和化学特性，评估其作为MRI对比剂的成像效果，为进一步优化MRI对比剂配方提供实验基础。方法：通过激光衍射分析仪、透射电镜及振动磁强计对油酸钠、壳聚糖和葡聚糖修饰的SPIONs的结构、粒径分布和磁性性能表征进行观察。选用32只SD大鼠随机分为4组，分别注射生理盐水(对照组)或油酸钠、壳聚糖或葡聚糖修饰的SPIONs，并于给药后10 min、30 min、60 min、3 h和6 h分别进行肝脏MRI扫描，观察三种SPIONs对肝脏T2弛豫时间的作用。结果：①激光衍射粒度分析、透射电镜和振荡磁强计检测结果显示，三种SPIONs粒子均匀度好，呈粒径10～20 nm的类球形结晶，均具有超顺磁性。②三种SPIONs注射后10 min，T2WI显示大鼠肝脏的信号强度均明显降低，与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)，以壳聚糖SPIONs的作用更明显，与另外2组间的差异有统计学意义(P<0.05)。③三种SPIONs注射后肝脏的T2值均表现为先降低后升高，在各个时间点与对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。壳聚糖组肝脏T2值下降最快，约30 min达最低峰值，达峰时间较另两组短(P<0.05)。三组间肝脏T2峰值两两比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论：油酸钠、壳聚糖和葡聚糖修饰的SPIONs均能缩短肝脏的T2弛豫时间，引起磁共振信号的变化；其中壳聚糖SPIONs对降低T2WI上肝脏信号的作用最明显，肝脏T2值达峰值时间最短，体内清除速率快，认为是较好的表面修饰材料。

磁共振成像； 对比剂； 超顺磁性氧化铁纳米粒子； 油酸钠； 壳聚糖； 葡聚糖

超顺磁性四氧化三铁纳米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIONs)具有较强的超顺磁性，作为MRI阴性对比剂的应用，能产生较好的MRI增强效果[1]，使分子成像的临床应用得到了突破，使得临床医师可以从解剖、生理和分子水平的进展来监测疾病或治疗。静脉注射后这些纳米颗粒被巨噬细胞吞噬，积聚在肝脏、脾脏、淋巴结、骨髓以及炎症部位。因此，SPIONs被广泛应用于炎症的检测[2]、体内细胞示踪[3]、热疗[4]、淋巴结检测[5]及抗癌药物的靶向传递[6]等。然而，对不同修饰材料的SPIONs作为磁共振对比剂的成像效果的评估文献报道非常少。本研究通过比较相同浓度相近粒径不同修饰材料包被的SPIONs应用于磁共振成像时的成像质量，旨在为进一步优化磁共振对比剂的配方提供实验基础。

材料与方法

1.实验动物的选择

选择6周龄SPF级SD雄性大鼠，体重200～220 g。由重庆医科大学实验动物中心提供，饲养于重庆医科大学附属儿童医院实验动物中心SPF级动物房，温度为20℃，相对湿度为45%。将大鼠随机分为4组，每组8只，分别使用。使用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)经腹腔注射麻醉大鼠，然后经尾静脉分别注射生理盐水(对照组)及油酸钠SPIONs、壳聚糖SPIONs和葡聚糖SPIONs混悬液，剂量50 μmolFe/kg。不同时间点行MRI检查前采用上述方法将大鼠重新麻醉。

2.药物的制备和分析

油酸钠、壳聚糖、葡聚糖修饰的SPIONs由重庆医科大学附属儿童医院生物材料实验室制备，制备方法参照文献报道[7-9]，将制备的SPIONs用生理盐水分别配制成50 μmolFe/mL的颗粒悬液，经超声振荡混悬，0.22 μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

样品结构表征包括粒径和磁学性质两个方面。使用激光衍射粒度分析仪、透射电子显微镜电镜观察三种不同修饰材料SPIONs的粒径大小分布，振动样品磁强计检测其磁学性质。

3.MRI扫描方法

使用GE Signa Excite 1.5T MR超导型扫描仪和3英寸线圈。MRI平扫序列及参数：SE T2-map，TR 1500 ms，TE 64 ms，视野12 cm×12 cm，层厚3 mm，间隔0.2 mm，矩阵256×192；FRFSE T2WI，TR 4000 ms，TE 81.4 ms，视野12 cm×12 cm，层厚3 mm，间隔0.2 mm，矩阵288×192，激励次数4。增强扫描序列和参数同平扫。增强扫描时间为给药后10 min、30 min、60 min、3 h和6 h。

测量各组中增强后10 min T2WI上肝脏的信号强度(signal intensity，SI)值。T2-map序列在工作站进行图像后处理，在肝实质最大层面选取ROI测量不同时间点肝脏的T2值，选择ROI时尽量避开大血管，增强前后所选ROI大小和部位相同。

4.统计学分析

使用SPSS 19.0统计软件包，采用studentt检验分析增强后不同时间点各组T2值的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

结　果

1.SPIONs的表征

透射电镜检测可见Fe3O4晶体与修饰物油酸钠、壳聚糖和葡聚糖彼此匀称的镶嵌在一起形成SPIONs复合物，微粒呈球形，表面规则光滑(图1a、2a、3a)，其Fe3O4晶体粒径为10～20 nm。

激光衍射粒度分析仪测得SPIONs复合物的粒径：油酸钠-SPIONs为166.2 nm，壳聚糖-SPIONs为164.8 nm，葡聚糖-SPIONs为140.7 nm。

经振荡磁强计检测，油酸钠-SPIONs的矫顽力为29.000Oe，剩磁为0.07801 emu，饱和磁化强度0.0794 emu(图1b)；壳聚糖-SPIONs的矫顽力为27.464Oe，剩磁为0.07435 emu，饱和磁化强度为0.0779 emu(图2b)；葡聚糖-SPIONs的矫顽力为29.463Oe，剩磁为0.07317 emu，饱和磁化强度为0.0734 emu，磁化曲线呈通过坐标原点的对称“S”型(图3b)。

2.增强后大鼠肝脏的SI

增强后10 min对照组、油酸钠组、壳聚糖组和葡聚糖组中T2WI上大鼠肝脏的信号强度分别为253.73±14.23、194.93±20.04、130.77±18.18和163.21±19.10。油酸钠、壳聚糖、葡聚糖修饰的SPI-ONs均能使T2WI上肝脏的信号降低(图4)，与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示增强效果较好。三个对比剂组之间两两比较，壳聚糖组肝脏SI与油酸钠组、葡聚糖组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1　在增强后不同时间点各组大鼠肝脏的T2值

注：*与油酸钠组比较，P<0.05；#与壳聚糖组比较，P<0.05；△与葡聚糖组比较，P<0.05。

3.不同修饰材料SPIONs的T2值

T2-map上不同材料修饰的SPIONs组中肝脏的T2值见表3。注射SPIONs纳米粒子后，随着时间的推移，肝脏信号出现先降低后升高的趋势(图5、6)，三组在各个时间点的肝脏T2值与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。壳聚糖组肝脏T2值在注射对比剂后30 min迅速下降达到最低值，葡聚糖组和油酸钠组则在约60 min时达最低值，壳聚糖组的达峰时间较另两组时间短(P<0.05)；三组的肝脏T2峰值的差异无统计学意义(P>0.05)。注射SPIONs后约6h壳聚糖组和葡聚糖组中肝脏的T2值明显上升，组间差异无统计学意义(P>0.05)，油酸钠组中肝脏T2值虽有上升但与另外两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。

讨　论

随着纳米技术的发展，磁性纳米生物材料在生物医学领域具有广泛的应用前景。四氧化三铁纳米粒子具有较强的超顺磁性，可被动物体内的网状内皮系统吞噬，是一种较为理想的MRI阴性对比剂[10]。作为MRI对比剂，既需要具有明显改善靶器官组织的信号特征的能力，还应具备低毒甚至无毒以及体内清除率快的特性。根据文献报道，本实验中采用实验室自制的油酸钠、壳聚糖和葡聚糖修饰的SPIONs，对大鼠无明显的急性毒性效应[8]。SPIONs增强MRI时组织信号强度的变化与巨噬细胞的数量及吞噬功能有关[11]。很多学者利用各种方法来增加细胞的摄取量，如受体介导或利用转染剂的方法等[12,13]。本实验中利用不同修饰材料包被SPIONs，增加其生物相容性，来达到增加细胞摄取量的作用。

本研究中选择油酸钠、壳聚糖和葡聚糖三种修饰材料使用化学共沉淀法来制备超顺磁性Fe3O4纳米粒子。其反应式为：

Fe2++2Fe3++8OH-=Fe3O4+4H2O

(1)

通过激光衍射法测得的本实验中制备的磁性纳米粒子复合体的粒径为140～160 nm，透射电子显微镜观察其Fe3O4核心的粒径为10～20 nm，样品均匀性好，说明三种修饰材料对SPIONs的Fe3O4核心粒径大小无明显影响。使用振动样品磁场计测得的三种修饰材料的SPIONs的矫顽力、剩磁及饱和磁化强度无明显差异，说明不同修饰材料对SPIONs的磁性无明显影响，这一结果与Farnoosh等[14]的实验结果基本一致。磁化曲线均为通过坐标原点的对称“S”形，说明当外加磁场为0时，SPIONs样品几乎没有磁滞现象，证实了三种纳米粒子在常温下表现出较好的超顺磁性[15]。

本研究中使用油酸钠、壳聚糖、葡聚糖修饰的SPIONs经大鼠尾静脉注射后(剂量50 μmol Fe/kg)，在1.5T MR T2WI上，大鼠肝脏信号较正常对照组均明显降低(P<0.05)，显示三种修饰物合成的SPIONs均有较好的增强效果。注射SPIONs后测量不同时间点的肝脏T2值，结果显示T2值均呈现先降低后升高的趋势，与对照组比较差异均有统计学意义。壳聚糖组在注射后30 min时肝脏T2值迅速下降至最低值，而油酸钠组与葡聚糖组均在60 min时达最低值。达峰时间的不同可能与不同修饰料的SPIONs被巨噬细胞的速率不同有关。超顺磁性壳聚糖纳米粒子由于修饰物壳聚糖表面带正电荷，能够与带负电荷的细胞膜表面发生静电吸附，促进了细胞吞噬过程[16,17]。Raynal等[18]通过实验证实葡聚糖修饰的SPIONs主要是通过清道夫受体介导的细胞内吞作用被摄取；而油酸钠作为表面阴离子活性剂，其修饰的SPIONs主要依附在细胞膜表面，通过局部细胞膜内陷，最终进入细胞的内涵体内，被巨噬细胞摄取[19,20]。因此，壳聚糖通过静电吸附被巨噬细胞吞噬的概率较其它两组高，故其在肝脏内聚集速度较快，使肝脏信号降低的达峰时间较短。而葡聚糖和油酸钠被巨噬细胞吞噬均为被动过程，两者达峰时间无明显差异，但均较壳聚糖达峰时间长。

壳聚糖组的肝脏T2最低峰值为(13.46±1.58) ms，油酸钠组为(14.23±1.86) ms，葡聚糖组为(13.81±1.71) ms，三组峰值间两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)，这可能与三组中注入大鼠体内的铁含量相同及巨噬细胞吞噬SPIONs的饱和浓度有关[21]。Trivedi等[22]报道纳米粒子的粒径会影响巨噬细胞对SPIONs的吞噬率，相同粒径的纳米粒子的巨噬细胞吞噬率相仿。而本课题前期对三种修饰材料的表征观察中已经证实三种对比剂的粒径大小相似，故巨噬细胞吞噬SPIONs后相应的肝脏T2值的峰值没有明显差异。

注射SPIONs后肝脏T2信号下降达峰值之后又逐渐升高，说明纳米粒子逐渐被机体清除，约6 h时壳聚糖组和葡聚糖组中肝脏T2值均明显上升，而油酸钠组中肝脏T2值虽有上升，但明显低于另外两组(P<0.05)，说明油酸钠体内清除速度较缓慢，可能与其生物相容性较差有关。有文献报道，油酸钠诱使红细胞发生氧化应激反应产生细胞凋亡，这也可能是油酸钠SPIONs体内生物相容性差的原因[23]。

综上所述，三种修饰材料的SPIONs作为MRI阴性对比剂均能降低肝脏的信号强度，且随时间的推移肝脏T2值呈先快速下降，后逐渐上升的特点，其中壳聚糖修饰的SPIONs具有毒性低、生物相容性高、缩短肝脏T2的达峰时间短、体内清除率快等优点，是较好的SPIONs表面修饰材料，为进一步将磁性纳米微粒作为MRI对比剂应用于临床提供了实验依据。

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Research on the imaging effect of sodium oleate-,chitosan- and dextran-modified SPIONs applied as the contrast agent of MRI

WANG Cui,HE Ling,LUO Cong,et al.Department of Radiology,Department of Orthopedics,the Affiliated Children's Hospital of Chongqing Medical University,Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders,Key Laboratory of Pediatrics in Chongqing,Chongqing International Science and Technology Cooperation Center for Child Development and Disorders,Chongqing 400014,China

Objective:To study the physical and chemical characteristics of sodium oleate,chitosan and dextran coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs),and to evaluate their imaging effects as MRI contrast agent,and to provide experimental basis for further improvement of MRI contrast agent compositions.Methods:With the aid of laser-diffraction analyzer,scanning electron microscopy (SEM) and vibration magnetometer,the morphology structure,particle size distribution and magnetic properties of three types of SPIONs (modified by sodium oleate,chitosan or dextran,respectively) were observed.Then,32 adult SD rats were selected and randomly divided into four groups,in each group saline (control group) or one of the three types of SPIONs was used as contrast medium.Liver MRI scans were performed at five time-points (10min,30min,60min,3h and 6h) after injection of contrast medium,and the T2relaxation time of liver in each group was measured and analyzed.Results:①Laser-diffraction analyzer,SEM and vibration magnetometer indicated that the fundamental physical properties of the three types of SPIOs were similar:Fe3O4nanoparticles were almost evenly distributed and presented in the form of sphere-like crystallizations,with diameters ranging from 10 to 20 nm;all of them had super paramagnetic property.②10minutes after injection of SPIONs,signal intensity of liver on T2WI decreased markedly with statistic significance (P<0.05) compared with control group,especially in chitosan group,there was significant difference in liver SI between chitosan group and the other groups.③After injection of the three types of SPIONs,the T2value of liver decreased at first and then increased,which was significant lower than that of control group at each time-point.Precisely,T2value of liver in chitosan group decreased much faster than that of the other two groups,its peak-time was about 30min after injection,which was shorter than that of the other groups.Further,there was no statistic difference among the peak values of the three groups (P>0.05).Conclusion:All of the sodium oleate,chitosan and dextran modified SPIONs under investigation can shorten the T2relaxation time and cause variations of magnetic resonance signals.To be emphasized,the chitosan-modified SPIONs degrade the resonance signal in a more obvious manner,make T2reaching its peak value at the earliest time,and can be removed rapidly from the body.Thus,it is considered to be a better choice for surface modification of SPIONs.

Magnetic resonance imaging； Contrast agent； Superparamagnetic iron oxide nanoparticles； Sodium oleat； Chitosan； Dextran

400014重庆，重庆医科大学附属儿童医院放射科/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿科学重庆市重点实验室/重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地(王翠、何玲、冯川、刘先凡)，骨科(罗聪)

王翠(1982—)，女，河北石家庄人，硕士，主治医师，主要从事儿科腹部影像诊断工作。

何玲，E-mail：heling508@sina.com；罗聪，E-mail：luocong919@yahoo.com.cn

重庆市卫计委资助项目(2015MSXM033)；重庆医科大学附属儿童医院资助项目(lcyj2014-4)；重庆市科委科技攻关(重点)项目(csct2011ggB1004)。

R445.2； R735.7

A

1000-0313(2016)08-0789-05

10.13609/j.cnki.1000-0313.2016.08.027

2015-12-25

2016-04-12)