梁江洪　李凤珍　龙朝阳　钟丽雁　柏春晖　梁　艳　蒋桂江　王苑俪

广西壮族自治区民族医药研究院,广西　南宁　530001



实验研究

用CIA模型探讨壮医滚克阳证与阴证动物模型的建立

梁江洪李凤珍*龙朝阳钟丽雁柏春晖梁艳蒋桂江王苑俪

广西壮族自治区民族医药研究院,广西南宁530001

目的:以胶原诱导性关节炎(CIA)模型为基础，附加模拟的风、寒、湿、热环境，建立符合壮医病因理论的动物模型。方法:将40只雌性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、阳证组与阴证组每组各10只，除空白外均采用弗氏不完全佐剂和牛II型胶原蛋白诱导大鼠CAI模型，阳证组在每天附加风、湿、热刺激持续1h，条件控制：风速5m/s，相对湿度90%，温度(37±1)℃；阴证组每天附加风、寒、湿刺激持续1h，条件控制：风速5m/s，相对湿度90%，温度(8±1)℃。比较各组大鼠关节炎-体长温度差值、计算关节炎症积分以及ELISA只测定TNF-α、IL-1β水平的差异结果:阴证组关节-体表温度差值、炎症指数方面均低于阳证组，差异有统计学意义(P<0.05)；阴证组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于阳证组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论:通过风、寒、湿刺激的CIA大鼠可做为阴证模型的参考，通过风、湿、热刺激的CIA大鼠可做为阳证模型的参考。同时也存在造模复杂化、大鼠死亡率增的缺点，有待进一步完善。

动物模型；滚克；类风湿关节炎；阳证与阴证；壮医

类风湿关节炎是临床常见的自身免疫性疾病，其发病机制非常复杂，主要的病理表现为滑膜增生、炎症细胞浸润、血管翳形成并造成软骨和骨质破坏[1-2]。目前常用CIA模型来研究类风湿关节炎的发病机制，但该模型的发生机制目前尚无定论，可以肯定：免疫系统对CⅡ的高度敏感性是该模型建立的主要原因[3]，细胞和体液免疫均参与了病理过程[4-5]。类风湿关节炎在壮医的病名为滚克，缘由风、寒、湿、热毒侵袭人体，阻滞三道两路而致病，临床辨证分为阳证、阴证。本研究尝试以CIA模型为基础，附加模拟的风、寒、湿、热环境，建立符合壮医病因理论的动物模型，为后续相关动物实验提供参考。

1　材料和造模

1.1实验材料SPF级雌性Wistar大鼠(生产许可证：SCXK2014-0002)，体重(110±20)g，购自广西中医药大学实验动物中心。牛Ⅱ型胶原蛋白(批号：150230)、弗氏不完全佐剂(批号：150207)、IL-1β(批号：1006-63)、TNF-α试剂盒(批号：1100-86)购于北京博蕾德生物科技有限公司。

1.2造模箱制作参考文献[6]自制造模箱，以自行改装的空调系统控制箱内温度，以超声雾化器雾化灭菌水控制箱内湿度，以鼓风机提供风源。1.3CIA大鼠造模方法在无菌条件下，用0.1mol/L冰醋酸充分溶解牛II型胶原蛋白，制成浓度为4mg/L溶液，再按1∶1体积与弗氏不完全佐剂混合、震荡并充分乳化，制成CII乳剂，保存于4℃冰箱备用。试验时每只大鼠CII乳剂0.25mL于颈、背、尾部分多点皮内注射致炎(初次免疫)，于7d后按上述方法再次免疫。

2　实验分组及方法

40只大鼠，适应性饲养7d后，随机选30只按上述方法造模，造模成功后再随机分为模型组、阳证组、阴证组，每组10只；余下10只未造模大鼠为空白组。均于室温(恒温(20±2)℃，相对湿度50%～60%)下正常喂养。阳证组在首次接受胶原蛋白注射开始同时每天给予风、湿、热刺激持续1h，条件控制：风速5m/s，相对湿度90%，温度(37±1)℃；阴证组在首次接受胶原蛋白注射开始同时每天给予风、寒、湿刺激持续1h，条件控制：风速5m/s，相对湿度90%，温度(8±1)℃。

3　观察和指标

3.1关节-体表温度差值各组大鼠以最肿胀关节体表温度与腹部体表温度差值进行比较。体表温度测量方法，于室温下，相同时间点用非接触式红外测温仪在相同的距离内测量。

3.2关节炎症积分采用关节炎指数积分法评定，评定依据为关节红肿程度和范围以及关节肿大和变形情况[7]。0分：无关节炎；1分：有红色斑点或轻度肿胀；2分：关节部位中度肿胀；3分：关节严重肿胀；4分：关节严重肿胀且不能负重。每个肢体最高积分为4分，每只鼠最高积分为16分。3.3血清TNF-α、IL-1β含量于第1次胶原蛋白注射后的第22天，水合氯醛麻醉各组大鼠，腹主动脉采血，分离血清待测，未测的血清放入-4℃低温冰箱保存。IL-1β、TNF-α均采用ELISA法，按照试剂盒说明书进行。

4　统计学处理

5　结果

5.1关节表面-体表温差关节表面-体表温差(简称差值)比较，空白组大鼠膝关节表面温度均低于体表温度，与模型组比较，差值明显增高，差异有统计学意义(P<0.01)。阴证组差值小于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，表明阴证组关节表面温差低于模型组；阳证组差值与模型组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，表明阳证组关节表面温差与模型组相当；阴证组差值与阳证组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，表明阴证组关节表面温差低于阳证组。见表1。5.2关节炎症指数空白组炎症指数为0，与模型组比较，炎症指数增高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，阳证组关节炎症指数差异无统计学意义(P>0.05)，阴证组关节炎症指数小于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明阴证组关节炎症程度低于模型组。与阳证组比较，阴证组关节炎症指数小于阳证组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明阴证组关节炎症指数小于阳证组。见表1。

表1　关节表面-体表温度差、炎症指数　±s)

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01，#P<0.05；与阳证组比较，△△P<0.05。

5.3炎症因子与空白组比较，模型组TNF-α、IL-1β值均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，阳证组TNF-α、IL-1β统计学差异(P>0.05)，阴证组TNF-α、IL-1β值小于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，表明阴证组TNF-α、IL-1β水平低于模型组。与阳证组比较，阴证组TNF-α、IL-1β值小于阳证组，差异有统计学意义(P<0.01)，表明阴证组TNF-α、IL-1β水平明显低于阳证组。见表2。

表2　血清中TNF-α、IL-1β含量

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.05；与阳证组比较，##P<0.01。

6　结论

本研究结果表明，阴证组关节-体表温度差值、炎症指数方面均低于阳证组(P<0.05)，阴证组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平均低于阳证组(P<0.05)。表明在比较成熟的CIA模型基础上，附加风、寒、湿、热等外界刺激，会对模型大鼠产生影响：通过风、寒、湿刺激的模型大鼠可做为阴证模型的参考；通过风、湿、热刺激的模型大鼠可做为阳证模型的参考。同时，结果表明，阳证组与模型组在表温度差值、炎症指数、血清TNF-α和IL-1β水平方面无统计学意义(P>0.05)，可说明CIA急性期多表现为阳证。本研究探索在CIA模型基础上建立壮医滚克病因学说中的阴、阳两证模型取得初步成效，同时也存在造模复杂化、大鼠死亡率增高的缺点，有待进一步完善。

[1]ScottDL, Wolfe F, Huizinga TW, et al. Rheumatoid arthritis[J].Lancet， 2010，376(9746),1094-1108.

[2]Kourilovitch M, Galarza-Maldonado C, Ortiz-Prado E3.Diagnosis and classification of rheumatoid arthritis[J]. Journal of Autoimmunity， 2014,48-49:26-30.

[3]Trentham D E,Townes A S,Kang A H.Autoimmunity to typeⅡcolla-gen:an experimental model of arthritis[J].J Exp Med,1977,146:857-866.

[4]汤文璐,李俊,徐叔云.Ⅱ型胶原性关节炎动物模型的研究概况[J].中国药理学通报,1998,14(6):495-498.

[5]陈柏松,徐玉东,钟淑琦,等.大鼠佐剂性关节炎模型的建立与评价[J].哈尔滨医科大学学报,2005,39(6):489-491.

[6]肖长虹,顾为望,李留洋,等.类风湿性关节炎风寒湿痹与风湿热痹动物模型的研究[J].中医杂志,1996,37(8):492-496.

[7]张钧用.现代药理实验方法[M].北京：北京大学，中国协和医科大学联合出版社，1998:1383.

(编辑：梁志庆)

2016-06-23

广西科学研究与技术开发计划课题(桂科攻13349006)。

梁江洪(1962-)，女，壮族，大学本科，副主任医师，从事风湿病的壮医诊治研究，E-mail:gxzyyyfsk2006@163.com

李凤珍(1967-)，女，壮族，大学本科，主任医师，从事风湿病的壮医诊治研究，E-mail:lifengzhen2005@163.com

R965.1

A

1007-8517(2016)17-0025-02