董文娟， 侯晓莉， 董 川*

(山西大学环境科学与工程研究中心，山西太原 030006)

人血清白蛋白(HSA)是人体血浆中含量最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60%，是维持血液胶体渗透压的主要成分和运输内源性及外源性物质的重要载体[1],能与许多内源及外源性化合物结合起到转运的作用。蛋白质中存在着酪氨酸和色氨酸残基，它们本身可发射荧光，这种内源荧光的猝灭过程是研究蛋白质和其他物质相互作用的重要方法。例如人们通过研究染料分子与蛋白质相互作用后的荧光特性变化，从而获得有关蛋白质大分子结构和性能的相关信息。水溶性苯胺蓝(AnB)是一种重要的三苯甲烷酸性染料，被广泛的用于羊毛、蚕丝及羊毛混纺的染色，且它的染色技术在植物、动物和环境科学等领域都展现出很好的应用潜力[2]。同时它还曾用作酸碱指示剂、生物染色剂用于神经组织、细胞、结缔组织的染色[3]。已有研究报道了利用水溶性苯胺蓝的吸光光度法来测定人血清白蛋白[4 - 6]，还未见用荧光法来研究苯胺蓝与蛋白质相互作用的报道。

本文采用荧光光谱法研究AnB与HSA的相互作用机制,研究二者相互作用的结合位点、结合常数，以及温度对结合常数的影响,并从热力学角度探讨它们之间的主要作用力类型。这对于阐明AnB与HSA相互作用机理，以及AnB对活体生物组织染色时的作用机制具有一定的意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CARY Eclipse荧光分光光度计(美国，VARIAN)(自带恒温装置)；TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；pHS-3C数显酸度计(上海雷磁仪器有限公司)。

HSA(Sigma)储备液：将HSA溶于0.5% NaCl 溶液,配制成1.0×10-4mol·L-1的储备液，于4 ℃下储存。AnB(分析纯，上海第三试剂厂)，配制成1.0×10-3mol·L-1的储备液避光保存；pH=7.4 的Britton-Robinson(B-R)缓冲溶液，所用试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

在10 mL比色管中加入一定量1.0×10-4mol·L-1的HSA溶液，用pH=7.4 的B-R缓冲溶液稀释至刻度，配制成工作溶液，取2 mL于石英杯中，于λex=293 nm，扫描 300～500 nm波长范围的发射光谱，然后用微量注射器将AnB溶液注射到石英杯中，搅匀，放置5 min后测量荧光。荧光的激发和发射狭缝宽度均为5 nm。

分别以△λ=15 nm和△λ=60 nm扫描AnB对HSA同步荧光光谱的影响，激发和发射狭缝均为5 nm。

2 结果与讨论

2.1 荧光猝灭光谱

图1 不同浓度AnB存在下HSA的荧光光谱Fig.1 Emission spectra of HSA in the presence of various concentration of AnB T=290 K,pH=7.4;λex=293 nm.cHSA=1.0×10-5 mol·L-1.a-e:cAnB:0,1.25×10-6,2.0×10-6,3.0×10-6,4.0×10-6 mol·L-1.

为了模拟人体生理环境，选用中性条件来研究AnB与HSA的相互作用。固定HSA浓度，在激发波长293 nm下扫描HSA的荧光光谱，其最大发射峰位于342 nm。测得加入含不同浓度AnB时体系的荧光光谱如图1。由图可见，随着AnB浓度的增加，HSA的荧光逐渐被猝灭，且发射峰红移14 nm，这表明AnB和HSA发生了相互作用。

2.2 荧光猝灭机理

引起HSA荧光猝灭的原因可能有静态猝灭或动态猝灭[7]。对于动态猝灭， 随着温度的升高，荧光物质的猝灭常数将增大，而静态猝灭则相反[8]。因此，为了阐明AnB对HSA的猝灭机制，本文研究了不同温度下，猝灭常数的变化。

荧光猝灭符合Stern-Volmer猝灭方程：

F0/F=1+KSV[Q]=1+τ0Kq[Q]

(1)

其中，F0为猝灭剂不存在时荧光体的发光强度，F为加入猝灭剂后的荧光强度；KSV为猝灭常数，[Q]为猝灭剂的浓度，Kq为双分子猝灭过程速率常数，τ0为荧光体的分子平均寿命。

图2 AnB猝灭HSA 的Stern-Volmer曲线Fig.2 Stern-Volmer curve of fluorescence quenching of HSA by AnB ()17 ℃，()27 ℃，()37 ℃ (λex=293 nm).

以F0/F对相应的[Q]作图，根据猝灭曲线的斜率可求得猝灭常数。图2为不同温度(17、27和37 ℃)下的Stern-Volmer曲线，从图中可以看出，曲线呈线性，且随着温度的升高斜率降低。

因为生物分子的荧光寿命τ0是10-8s[9]，KSV是图2中直线的斜率，根据方程：

KSV=Kqτ0

(2)

由此计算得到猝灭常数Kq及其线性相关系数r，见表1。猝灭剂与生物大分子的最大猝灭分散碰撞常数是 2.0×1010L·mol-1·s-1[10]。显然，AnB对HSA荧光的猝灭过程速率常数大于扩散控制的速率常数。由此推断AnB对HSA荧光的猝灭不是由动态猝灭引起的，而是静态猝灭。

表1 不同温度下苯胺蓝与HSA的相互作用参数

2.3 结合常数和结合位点数

图3 AnB对HSA的静态猝灭曲线Fig.3 The curves for quenching of AnB to HSA ()17 ℃ ()27 ℃ ()37 ℃.

利用静态猝灭的公式：lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q]处理实验数据。分别作不同温度下的lg(F0-F)/F对lg[Q]的曲线图，如图3所示。由直线截距和斜率可求得不同温度下的结合常数KA和结合位点数n，计算结果见表1。由此可见AnB和HSA的结合常数较大，结合位点在1附近，表明AnB和HSA形成1∶1复合物。

2.4 AnB与HSA的作用力类型

染料小分子与蛋白质间的作用力属于分子间的弱相互作用，包括氢键、范德华力、静电引力和疏水力，不同小分子与蛋白质的作用力不相同[11]。为了进一步研究AnB与HSA的作用力类型，根据Gibbs-Helmholtz方程计算不同温度下的热力学参数，结果见表2。从表2的数据可以看出，△G<0，说明在等温等压条件下没有非膨胀功存在下，AnB与HSA的结合是吉布斯自由能驱动的自发过程，而△H<0和△S>0，说明AnB与HSA的相互作用也是由焓、熵驱动的自发过程，这就表明两者存在静电作用和疏水作用。

表2 不同温度下苯胺蓝与HSA的热力学参数

2.5 AnB与HAS结合的同步荧光光谱

固定激发波长与发射波长间的间距，扫描激发和发射单色器即得同步荧光光谱。这种光谱已被用于蛋白质构象变化的分析，由△λ=15 nm所得的同步荧光只显示蛋白质酪氨酸残基的荧光，△λ=60 nm所得的同步荧光只显示蛋白质色氨酸残基的荧光[13]。因残基的最大激发和发射波长与所处微环境的极性有关，由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。固定HSA的浓度，逐渐增加AnB的浓度，分别以△λ=15 nm和△λ=60 nm绘制HSA的同步荧光光谱。图4a和图4b分别为HSA中的酪氨酸和色氨酸残基的荧光谱。可以看出在此实验条件下HSA的荧光谱主要来自色氨酸残基，且随着AnB浓度的增加，酪氨酸的最大发射波长蓝移，色氨酸的最大发射波长略有红移，表明AnB的加入引起了HSA构象的变化。

图4 苯胺蓝对HSA 构象的影响Fig.4 The effect of AnB on the configuration of HSA (a)△λ=15 nm;(b)△λ=60 nm.cHSA=1.0×10-5 mol·L-1;cAnB：(1)0,(2)1.0；(3)5.0；(4)8.0(×10-5 mol·L-1).

3 结论

本文用荧光光谱法研究了水溶性苯胺蓝与人血清白蛋白的结合反应。研究表明苯胺蓝对HSA的猝灭机理为静态猝灭，测得了该反应在不同温度下的结合常数及结合位点数，并探讨了它们的相互作用机理，结果表明苯胺蓝以静电作用和疏水作用与HSA相互作用.进一步用同步荧光技术研究了AnB对HSA构象的影响，结果表明，HSA的荧光主要源于色氨酸残基，AnB对HSA的构象产生了影响。