马 维，黄泓轲，王玉婷，闵 清，祝晓庆，王 诗*

(1.湖北科技学院药学院，湖北咸宁 437100；2.乐山职业技术学院药学系，四川乐山 614000；3.武汉市普爱医院，湖北武汉 430072)

雌二醇(E2)是育龄妇女体内卵巢或黄体分泌的受体水平活性最高的雌激素，其浓度的过高或过低都会导致生殖及内分泌系统紊乱，因此准确地测定E2浓度对于相关疾病的诊断和治疗具有极其重要的意义[1,2]。目前用于E2测定的方法以免疫分析法[3]和高效液相色谱[4]最为常用，但免疫法由于灵敏度、选择性以及试剂污染、假阳性等因素制约了其应用；而色谱法则对技术要求高，预处理繁琐。近年来研究者利用传感器对E2进行测定，如蛋白A与联硫基二(琥珀酰亚胺丙酸盐)修饰电化学免疫传感器[5]、蛋白A-纳米金-丝网印刷免疫传感器[5]、纳米金/巯基蛋白G修饰金电极免疫传感器[7]，以及在丝印碳电极上固定抗体(兔抗小鼠IgG和单克隆小鼠抗-E2)[8]检测E2。然而免疫传感器制备工艺比较复杂，影响稳定性和一致性的因素较多，会影响检测导致测量结果不准确，临床使用面临重现性差的问题。

本研究采用丝网印刷技术制备丝印传感器，修饰多壁碳纳米管(MWCNTs)-十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，用于大鼠血样中E2的直接测定。该电极能够满足生物样本中E2的测定，减少了前处理过程，能够实现快速、批量、连续、便捷的诊断目的，在临床诊断方面具有应用前景。

1 实验部分

1.1 主要仪器、试剂及受试动物

CHI660E电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)；实验室用多功能丝网印刷设备(珠海凯为电子元器件有限公司)；pHS-3E酸度计(上海雷磁)；KQ-100E超声波清洗器(昆山舒美)；SPM-9500J3扫描探针显微镜(Japan,Shimadzu);Quanta200 扫描电镜(Holland,FEI);JFC1600精镀仪(Japan,JEOL)。

雌二醇(E2，阿拉丁)；多壁碳纳米管(MWCNTs,中国科学院成都有机化学研究所)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,Amresco)；血清雌二醇(E2)-放免试剂(RIA)(南京建成)；丝印碳油墨(Acheson)；银油墨(Acheson)；Ag/AgCl油墨(徐州英剑纳米科技有限公司)；绝缘油墨(JUJO)；PVC片材(上海新立医疗器械有限公司)，其他试剂均为分析纯。实验用水均为二次蒸馏水。

SPF级雌性KM小鼠，体重17～20 g；雌性SD大鼠，体重180～240 g，购自湖北省疾控中心。

1.2 MWCNTs-CTAB/SPE的制备

利用丝网印刷技术于PVC基材表面逐层套印导电银轨、工作电极、辅助电极、Ag/AgCl参比电极后，置温度70 ℃烘箱中烘干，最后印刷绝缘层，紫外烘干，得到丝印电极(SPE)[9]。

CTAB溶于蒸馏水中配制成CTAB溶液，再加入MWCNTs，多次超声分散后使MWCNTs/CTAB修饰液分散均匀。移液器吸取MWCNTs-CTAB修饰液滴涂于工作电极表面，于室温自然干燥得到MWCNTs-CTAB/SPE，储存于干燥器中，备用。

1.3 MWCNTs-CTAB/SPE在生物样本中的应用

1.3.1MWCNTs-CTAB/SPE特异性实验SD大鼠随机分为空白组(生理盐水)，E2低剂量(0.18 mg/kg)、中剂量(0.9 mg/kg)及高剂量(4.5 mg/kg)组，每组6只，腹腔给药后，分别于6、12、18、21、22 、23、26、32及48 h采用眼底静脉采血，EP管采用EDTA-Na2抗凝处理。将100 μL血样加入到100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂缓冲液(pH=12)中，采用MWCNTs-CTAB/SPE测定血样中E2含量。48 h后处死大鼠，取出卵巢和子宫，称重脏器与体重并记录脏器指数。

1.3.2不同方法测定血样中E2KM小鼠摘眼球取血，SD大鼠眼底静脉采血，EP管采用EDTA-Na2抗凝处理。100 μL血样加入到100 μL的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂缓冲液(pH=12)中，采用MWCNTs-CTAB/SPE测定血样中E2含量。血样中分别加入1.0×10-10、3.0×10-10和5.0×10-10mol/L的E2，计算加标回收率。将E2标准品、血清样品、标记物和抗体按放免试剂盒规定依次加入试管中，混匀，37 ℃水浴1 h，待反应平衡后，加入分离剂，充分混匀，室温10 min，将各管插入γ放射免疫计数器上放置10 min，弃掉上清液，测各管沉淀的放射性计数(CPM)。

1.4 E2的电化学测定方法

采用电化学工作站，以MWCNTs-CTAB/SPE测定E2，电解液为含不同浓度E2的0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂缓冲液(pH=12)。在-1.0～1.0 V(vs.Ag/AgCl)范围进行循环伏安法(CV)扫描，在-0.8～0.8 V(vs.Ag/AgCl)范围进行方波伏安法(SWV)扫描，测定不同浓度的E2，确定峰电流与其浓度的关系。

2 结果与讨论

2.1 SPE表征

通过扫描电镜(SEM)分别对未修饰电极和修饰电极(MWCNTs-CTAB/SPE)进行表征。未经过修饰的工作电极表面的碳墨颗粒相互间关联较少，整体结构疏松，凹凸不平(图2A)；经过修饰后，工作电极表面布满MWCNTs，由于工作电极表面电化学特性得到改变，反应比表面积也增大，进而有利于电子在工作电极表面传递，有利于E2在电极表面富集(图2B)。MWCNTs-CTAB/SPE在原子力扫描电镜(AFM)下进行观察。由图2C可以看出，未修饰的工作电极表面起伏大，分布不均匀；经过修饰的工作电极表面变得平滑，MWCNTs-CTAB在其表面分散良好。

2.2 E2在MWCNTs-CTAB/SPE上的电化学特性

采用循环伏安法(CV)考察E2在裸SPE(bare SPE)、MWCNTs修饰SPE(MWCNTs/SPE)、CTAB修饰SPE(CTAB/SPE)和MWCNTs-CTAB修饰SPE(MWCNTs-CTAB/SPE)表面的电化学响应。如图3所示，未修饰的电极对E2电化学响应较小，在0.166 V附近出现氧化峰，未出现还原峰；相同条件下，MWCNTs修饰的电极，由于MWCNTs由于自身良好的导电性能，大的比表面积，显著提高了E2的峰电流，加速其电子转移，氧化峰电位移动至0.111 V，在-0.562 V出现还原峰；CTAB修饰的电极，由于CTAB与E2的疏水相互作用，虽然氧化峰电位移动至0.235 V，但E2在电极表面的氧化峰电流也明显增大；在CTAB的作用下MWCNTs分散均匀，并对MWCNTs起固定作用[10]。MWCNTs起到加快异相界面电子传递速率的作用[11]，对E2的催化活性也逐渐增加，导致MWCNTs-CTAB修饰电极上E2的氧化峰电流得到了显著的提高。

2.3 实验条件的影响

2.3.1缓冲溶液的影响采用循环伏安法考察E2分别在NaH2PO4-柠檬酸、Na2CO3-NaHCO3、Na2HPO4-NaH2PO4、HAc-NaAc、NaOH-硼砂等不同种类缓冲液中在MWCNTs-CTAB/SPE表面的电化学响应。在0.1 mol/L 的Na2CO3-硼砂缓冲液中氧化峰峰形较好、峰电流较大。考察不同pH值0.1 mol/L Na2CO3-硼砂缓冲液中E2的电化学响应。结果表明，在碱性条件下，E2氧化峰峰形较好，且无杂峰干扰，当缓冲液pH值为7～12时，E2的峰电流随着缓冲液pH值的增大而增大，电位随pH升高而向负电位方向移动。当缓冲液pH值为12时，峰电流最大，灵敏度最高。故选择pH值为12的0.1 mol/L Na2CO3-硼砂缓冲液为测定介质。

2.3.2扫描速率对E2电化学响应的影响在不同扫描速率下用循环伏安法测定E2在MWCNTs-CTAB/SPE表面的电化学响应。由图4可以看出，随着扫描速度的增加，峰电流增加。在20～300 mV/s 范围内，峰电流与扫描速率成正比；随扫描速率的增加，峰电位正移，氧化峰电流ip与扫描速度平方根v1/2存在良好的线性关系，说明E2在电极上的氧化过程受扩散控制。

2.3.3修饰剂用量的影响实验表明随MWCNTs-CTAB的浓度逐渐增加，E2的峰电流逐渐增加，但浓度超过0.5 mg/mL时，峰电流反而变小，故本实验选择MWCNTs-CTAB的浓度为0.5 mg/mL。同时，0.5 mg/mL MWCNTs-CTAB修饰剂用量从1.0 μL增加到3.0 μL时，E2的峰电流随着修饰量增加而显著增大，这是基于电极表面催化活性位点增多。当修饰剂量再增加至5.0 μL时，峰电流反而降低。此时，电极表面的膜达到一定的厚度，已超过最佳负载量从而阻碍了E2在电极表面的氧化反应。故本实验的修饰剂选择为0.5 mg/mL MWCNTs-CTAB，用量2.0 μL。

2.3.4SWV测定条件优化采用SWV法进一步探讨E2在MWCNTs-CTAB/SPE表面的方波伏安特性。考察了不同扫描频率(10、15、20、25、30 Hz)下E2的SWV曲线。随着扫描频率的增加，E2的峰电流逐渐增大，超过20 Hz，峰电流减小(图5A)；在不同电位增幅(8，10，12，14，16 mV)下，SWV测定E2，随着电位增幅的增加，E2峰电流逐渐增大，超过12 mV，峰电流减小(图5B)。因此SWV法的测定条件经过优化为起始电位:-0.8 V,终止电位:0.8 V,电位增量：12 mV,振幅:25 mV,频率：10 Hz。

2.4 工作曲线和检测限

在0.1 mol/L的Na2CO3-硼砂缓冲溶液(pH=12)中，采用SWV法制作E2的标准曲线，其曲线方程为：ip(μA)=2.147c(10-8mol/L)+0.0430，R=0.9968。E2的氧化峰电流与其浓度在5.0×10-10～1.0×10-8mol/L时呈现很好的线性关系，检测限为5.0×10-11mol/L。

2.5 干扰实验

E2在0.31 V附近产生一个氧化峰，通过在测定体系中逐步加入雌酮(E1)及雌三醇(E3)，发现E1和E3均会在附近产生一个叠加的氧化峰，从而对E2的测定产生干扰。由于E1、E2和E3在结构上存在很大的相似性，因此E1和E3对生物样品中E2的测定产生一定的干扰。但是由于生物血样中雌激素主要以E2为主，E1和E3的含量相对较低，而且E1主要存在于绝经妇女体内，E3主要存在于妊娠期妇女体内，因而E1和E3对于常规的血样中E2的测定不会造成干扰。其他100倍的金属离子如Zn2+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+无氧化还原峰，基本上不干扰E2的测定(误差<5%)。

2.6 精密度和稳定性

随机抽取同一批次与不同批次制备的MWCNTs-CTAB/SPE，分别测定1.0×10-10mol/L、5.0×10-10mol/L、10×10-10mol/L E2。同一批次相对标准偏差(RSD,n=5)分别为4.74%、4.43%、5.26%；不同批次的RSD分别为7.09%、6.35%、6.10%。将制备好的MWCNTs-CTAB/SPE置于干净无尘的塑料袋中，4 ℃干燥保存，3个月内进行测定，E2的测定基本不受影响。

2.7 MWCNTs-CTAB/SPE在生物样本中的应用

2.7.1MWCNTs-CTAB/SPE特异性实验给予大鼠注射外源性E2后，大鼠体内的E2含量呈现规律性变化，在22 h附近达到最大吸收峰。分别给予大鼠注射低、中、高剂量的E2后，大鼠体内的E2浓度表现出较好的量效关系，说明MWCNTs-CTAB/SPE能特异性地测定血样中的E2(图6A)。通过计算大鼠卵巢和子宫脏器指数，结果发现，同空白对照组大鼠卵巢和子宫脏器(图6B)相比，给予低剂量E2(0.18 mg/kg)的大鼠卵巢和子宫脏器指数出现明显增加，子宫壁明显增厚，这可能是E2促进了子宫细胞增生；给予中剂量E2(0.9 mg/kg)的大鼠卵巢和子宫脏器指数略微增长，和对照组无明显差异；给予高剂量E2(4.5 mg/kg)的大鼠卵巢和子宫脏器指数反而下降，子宫出现一定程度的萎缩，这可能是高浓度的E2抑制了子宫的机能(图6C)。

2.7.2MWCNTs/CTAB/SPE测定不同血样中E2的含量分别利用MWCNTs/CTAB/SPE测定大鼠及小鼠血样中E2含量，在上述基础上，继续增加E2浓度。随着E2浓度的升高，峰电流值与浓度呈线性关系，加样标准曲线相关系数分别为0.9941与0.9933。计算得到大鼠血中的E2含量为7.91×10-10mol/L，小鼠血中的雌二醇含量为2.24×10-9mol/L。

2.7.3不同方法测定小鼠血样中E2的含量采用MWCNTs/CTAB/SPE和RIA法分别测定小鼠血清中E2，再加入不同浓度 E2溶液测定加样回收率。回收率测定结果见表1。

表1 小鼠血样中E2回收率测定(n=5)

3 结论

MWCNTs-CTAB/SPE制备简单，制备工艺容易标准化，便于进行质量控制以及长期保存。通过给予大鼠注射外源性E2后，在22 h附近达到最大吸收峰，并且浓度变化曲线与给药量表现出较好的量效关系。另外通过计算大鼠子宫和卵巢脏器指数，发现低剂量E2能促进子宫壁加厚，高剂量的E2反而导致子宫萎缩。以上结果表明MWCNTs-CTAB/SPE对生物样本中的E2具有足够的灵敏度，能够直接用于生物样本的测定，可以成为进行E2相关性研究和药物筛选及临床诊断辅助的有效工具。