安秀红，厉恩茂，李 敏，李 壮，张修德，程存刚



苹果基因表达及蛋白互作分析

安秀红，厉恩茂，李 敏，李 壮，张修德，程存刚

（中国农业科学院果树研究所/农业部园艺作物种质资源利用重点实验室，辽宁兴城 125100）

【目的】克隆苹果茉莉酸信号途径阻遏因子基因，并对其表达及蛋白互作进行分析，为进一步研究的功能奠定基础。【方法】以TIFY及Jas功能域为探针，在苹果基因组中进行比对，获得多个同源基因，对其中的一个基因设计引物进行克隆；利用DNAMan软件对该基因编码蛋白的分子量、等电点进行预测；利用SMART在线分析软件对该蛋白的功能域进行分析；利用MEGA5.0对该蛋白与拟南芥JAZ家族蛋白构建系统发育树；利用荧光定量PCR分析该基因在苹果不同组织器官、茉莉酸甲酯及创伤处理下的表达情况；利用PlantCARE在线软件分析该基因启动子区域的顺式作用元件；利用酵母双杂交系统检测MdJAZ1蛋白的二聚化及其与拟南芥AtCOI1蛋白的互作关系。【结果】开放阅读框为1 149 bp，编码382个氨基酸残基，其蛋白的分子量为40.536 kDa，等电点9。氨基酸序列分析显示，该蛋白包含保守的TIFY及Jas结构域；系统发育树分析显示，MdJAZ1蛋白与拟南芥JAZ家族AtJAZ3、AtJAZ4亲缘关系最近；qPCR结果显示，在苹果的根、茎、叶、花及果实等组织中都有表达，但表达水平存在明显差异，其中根中的表达量最高，果实中的表达量最低；该基因还能被茉莉酸甲酯及创伤处理诱导表达，均在1 h内达到最高表达水平；启动子分析显示，启动子中包含多个ABA、乙烯、抗病及逆境胁迫等响应元件，此外，还包含多个MYB结合位点；酵母双杂交结果显示，MdJAZ1蛋白能与其自身相互作用形成同源二聚体，还可与拟南芥中同源性较近的AtJAZ3、AtJAZ4蛋白相互作用形成异源二聚体，并且在冠菌素存在时，MdJAZ1蛋白可与拟南芥F-box蛋白AtCOI1相互作用。【结论】受茉莉酸甲酯及创伤诱导表达，其蛋白能形成同源及异源二聚体，且在冠菌素存在时可与AtCOI1互作。

苹果；茉莉酸；；表达；蛋白互作

0 引言

【研究意义】茉莉酸（jasmonic acid，JA）是植物重要的信号分子之一，在植物生长发育、病菌响应及多种非生物胁迫等方面均具有重要的作用[1-5]。JASMONATE ZIM DOMAIN（JAZ）家族蛋白不仅是茉莉酸信号途径的重要组分，同时也是联络植物中不同信号途径的节点[6]，因此，分离苹果中的，并对其表达及蛋白互作进行分析，对深入研究苹果JAZ家族基因功能及苹果茉莉酸信号途径均具有重要意义。【前人研究进展】茉莉酸信号转导途径的研究最早在模式植物上开展，其信号途经中的多个组分均已被鉴定。编码F-box蛋白[7]，其突变体表现出多种茉莉酸不敏感的表型[8]，且编码蛋白能够与ASK、CUL1、RBX1形成SCFCOI1蛋白复合体，该复合体能够特异识别茉莉酸的活性物质JA-Ile等[9-11]。而SCFCOI1复合体的靶蛋白JAZ直到2007年才被鉴定出来[12-13]。目前，葡萄、水稻、大豆、玉米等中的逐渐被分离出来[14-17]。属于TIFY家族成员，该亚家族蛋白包含保守的TIFY和Jas功能域[18]。研究显示，Jas功能域决定了JAZ蛋白对茉莉酸的响应。拟南芥中共包含12个，不同之间功能冗余，、、和突变体以及、的过量表达植株均没有明显的表型[12-13]，而过表达功能域部分或者完全缺失的，转基因植株对茉莉酸的处理部分或者完全不敏感[19-20]。然而，水稻上的研究显示，过量表达能够促进转基因植株对盐及甘露醇胁迫的抗性[14]，此外，还能影响水稻谷粒大小及产量[21]；玉米中的研究显示，过量表达导致转基因拟南芥对JA、ABA及PEG处理不敏感等[22]；大豆中的研究显示，过量表达提高植株对盐碱的抗性[23]。JAZ蛋白能够与转录因子相互作用，进而抑制转录因子的转录活性。MYC是茉莉酸信号途径下游重要的转录因子，能调控多个茉莉酸响应基因的表达[24-27]，在低茉莉酸条件下，JAZ与MYC蛋白相互作用，抑制MYC蛋白的转录活性，从而抑制下游茉莉酸响应。当植物感受到茉莉酸信号时，JAZ蛋白发生泛素化降解，释放MYC蛋白，启动下游茉莉酸响应[12-13,28]。此外，JAZ蛋白还能够与多个MYB及bHLH蛋白相互作用，参与植物花青苷积累、表皮毛发育及植物的育性调控[5,29-30]。JAZ还可与EIN3、DELLA等蛋白相互作用介导茉莉酸信号与乙烯、赤霉素、光信号等之间的相互作用[31-35]，因此，JAZ蛋白很可能是联络茉莉酸信号及其他信号途径的节点。【本研究切入点】苹果中茉莉酸信号途径的研究尚处于起步阶段，参与该信号途径的大部分基因功能尚未被鉴定，笔者前期已经克隆了苹果中的6个[30]，同时，Li等[36]也对苹果中的进行了分析及命名，基于JAZ蛋白在茉莉酸信号途径中的重要作用，本研究对前期获得的苹果中一个（）进行系统研究。【拟解决的关键问题】利用生物信息学对的序列特性进行分析；利用荧光定量qPCR技术分析该基因在不同组织器官及茉莉酸、创伤诱导条件下的表达水平；同时利用酵母双杂交鉴定MdJAZ1蛋白的二聚化及与F-box蛋白AtCOI1的相互作用，为进一步研究MdJAZ1蛋白的泛素化降解及其在茉莉酸信号途径中的重要作用奠定基础。

1 材料与方法

试验于2013—2015年在中国农业科学院果树研究所进行。

1.1 试材

试验所用材料为中国农业科学院果树研究所8年生‘Gala’苹果树。分别取‘Gala’苹果树的根（新生根系）、茎（一年生枝）、幼叶、开放花及成熟期的着色果实。所有试材放入液氮中速冻，-70℃超低温冰箱中保存备用。

‘Gala’组培苗为每隔1个月继代一次，选取生长状态一致的苗进行处理。用50 μmol·L-1的茉莉酸甲酯处理组培苗，分别于0、1、3、6、9和12 h取样，样品于液氮中速冻，-70℃超低温冰箱中保存备用。创伤处理：每片叶叶缘约1/5处被锋利的手术刀片划伤，分别于0、1、3、6和9 h取受伤叶片，于液氮中保存。

本试验中使用的大肠杆菌菌株、PCR mix混合液、质粒提取试剂盒等购自北京全式金生物技术有限公司，RNA提取试剂盒为Qiagen产品，反转录试剂盒、T载体、高保真酶及SYBGreen I等购自大连宝生物工程有限公司，酵母菌株、-Trp/-Leu、-Trp/-Leu/-His/-Ade等为Clontech产品。

1.2 RNA提取及cDNA第一链的合成

根据RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）的说明书提取植物RNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳及分光光度计对提取RNA的完整性及浓度进行检测。利用反转录试剂盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa）反转录，得到第一链cDNA，用于基因的克隆。利用反转录试剂盒PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）对不同组织及处理样品的RNA进行反转录，用于荧光定量分析。

1.3 基因克隆

以拟南芥TIFY及Jas功能域为探针，在苹果基因组中进行blast，获得多个同源序列，对其中一个序列进行扩增，命名为。根据序列设计特异引物进行扩增，PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃ 35 s，55℃ 35 s，72℃ 50 s，28个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带进行回收，回收产物连接到克隆载体T，之后转化大肠杆菌，把筛选得到的阳性克隆送样进行测序。

1.4 生物信息学分析

利用DNAMan对MdJAZ1蛋白的等电点、分子量等进行预测；利用SMART在线分析软件对MdJAZ1蛋白的功能域进行分析；利用MEGA5.0软件对MdJAZ1与拟南芥中的JAZ家族成员进行进化分析；利用PlantCARE软件对启动子区域顺式作用元件进行分析。

1.5 表达分析

设计引物（表1），扩增的3′UTR部分，根据3′UTR序列设计定量引物，以苹果作为内参，对的表达进行荧光定量分析。参照TaKaRa SYBRGreen I的说明书进行，反应体系共20 μL，包括ddH2O 7 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，SYBR Solution 10 μL，每个样品设3个重复。

1.6 酵母双杂交

方法参照Clontech说明书进行，设计酵母双杂交引物（表1）扩增及拟南芥基因、、、，回收PCR产物，连接克隆载体T，转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆。经测序确认后，提取质粒，进行双酶切，分别连接到及中，、、及片段分别连接到中。将重组质粒分别转化酵母菌株，以及-共转化的酵母菌为对照，转化后分别涂布在筛选培养基SD/-Trp/-Leu中，30℃倒置培养3d。之后，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade筛选培养基上进行筛选。MdJAZ1与AtCOI1蛋白的互作在含有60 μmol·L-1冠菌素的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade筛选培养基上进行检测。

2 结果

2.1 苹果基因克隆及序列分析

以拟南芥TIFY及Jas功能域为探针在苹果基因组数据库中进行比对，获得多个同源基因，对其中的一个同源基因进行序列扩增，命名为（比对发现，Li等[36]将其命名为）。的ORF长为1 149 bp，编码382个氨基酸残基。DNAMan分析显示，MdJAZ1蛋白等电点为9，分子量为40.536 kDa。蛋白分析显示，MdJAZ1蛋白包含两个保守的功能域，分别是TIFY功能域及C端的Jas功能域（图1）。

设计3′特异引物F1及F2，分别利用F1+B26，F2+B25两对引物扩增的3′UTR部分，经过测序进行确定，该基因的3´UTR长度为234 bp。

利用MEGA5.0软件将该基因编码蛋白与拟南芥中的JAZ家族成员构建进化树。结果显示，MdJAZ1蛋白与拟南芥AtJAZ3、AtJAZ4亲缘关系最近（图2）。

图2 MdJAZ1蛋白与拟南芥JAZ家族成员进化树分析

2.2的组织表达分析

荧光定量qPCR结果显示，在所检测苹果根、茎、叶、花及果实等不同组织中均有表达，但是表达存在明显差异，其中果实中表达量最低，花中次之，之后是茎、叶，根中表达量最高（图3）。

不同小写字母表示不同组织中表达在0.05概率水平的差异显著性（t-检验）Different lowercase letters indicate significant difference of gene expression in different tissues at 0.05 probability level (t-test)

2.3 茉莉酸甲酯及创伤诱导条件下的表达分析

模式植物研究显示，茉莉酸处理短时间内JAZ家族基因表达明显上调，为了验证苹果中的是否也受到茉莉酸诱导，检测了茉莉酸甲酯处理条件下该基因的表达情况。荧光定量结果显示，能够响应茉莉酸甲酯处理，在处理1 h表达迅速增高，大约为0 h的8倍，3 h时有所下调，为0 h的4倍左右，之后一直到12 h维持在稳定的水平（图4）。另外，对苹果组培苗叶片进行创伤处理，检测不同处理时间内的表达，结果显示，在创伤处理1 h后表达明显上调，为未处理时的16倍，随着处理时间延长，表达持续下调（图4）。

图4 MeJA及创伤处理条件下MdJAZ1的表达

2.4启动子顺式作用元件分析

为进一步探索的表达特性，对该基因起始密码子上游1 500 bp序列进行扩增。利用在线分析软件PlantCARE对该基因启动子中存在的顺式作用元件进行分析。结果显示，该基因启动子中包含胚乳表达的调控元件、昼夜节律调控元件、植物激素ABA及乙烯响应元件、低温、创伤、抗病及逆境胁迫响应元件，此外，还包含多个MYB结合位点（表2），暗示表达也可能受到多种植物激素及低温、干旱等胁迫的影响。

表2 MdJAZ1启动子顺式作用元件分析

2.5 MdJAZ1蛋白互作分析

JAZ家族蛋白能够通过TIFY功能域相互作用，形成同源及异源二聚体，且这种相互作用是不依赖于茉莉酸信号的，但并不是所有的JAZ蛋白都可以形成同源或异源二聚体[37]。利用酵母双杂交检测MdJAZ1蛋白与其自身及拟南芥中同源性较高的JAZ蛋白互作关系的结果显示，MdJAZ1蛋白不仅可与其自身相互作用形成同源二聚体，也可与同源性较近的拟南芥蛋白AtJAZ3及AtJAZ4相互作用形成异源二聚体，但不与AtJAZ9蛋白互作（图5）。COI1形成的SCFCOI1蛋白复合体作为茉莉酸信号途径的受体复合物，当感应到茉莉酸信号时，该复合物结合JAZ蛋白，通过26S蛋白酶体途径降解JAZ蛋白，因此检测了MdJAZ1蛋白与拟南芥AtCOI1蛋白的互作关系。结果显示，仅在冠菌素（茉莉酸活性物质的类似物）存在时，AtCOI1蛋白才与MdJAZ1相互作用（图5）。

不同组合质粒共转化酵母菌，酵母菌落分别在-Trp/-Leu和-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上培养，X-gal作为染色剂进一步对互作蛋白进行确认

3 讨论

茉莉酸作为植物中不可或缺的一种激素，在植物生长发育及应对生物和非生物胁迫等方面起着至关重要的作用[1-3]。JAZ蛋白是茉莉酸信号途径中的一个重要组分，在茉莉酸信号途径中起着负调控作用[12-13]。JAZ蛋白属于TIFY大家族，该家族包含JAZs、ZIM、PPD三类成员，他们均包含一个保守的TIFY功能域[18,38]。本研究中的MdJAZ1蛋白包含保守的TIFY及Jas结构域（图1），属于典型的JAZ家族蛋白。系统发育树显示，MdJAZ1蛋白与拟南芥AtJAZ3、AtJAZ4亲缘关系最近（图2），暗示可能参与苹果中的茉莉酸信号转导途径。

水稻中的研究显示，不同在不同的组织器官中表达差异较大，、及等基因在水稻各组织中均有表达，且表达量都很高，在水稻愈伤及根中表达较高，而在幼根、幼穗及茎干等组织中表达较高[14]。玉米中表达也不同，有的是组成型表达，如等；有的在营养器官中表达较高，如、等；也有的在生殖器官中表达较高，如等[39]。Li等[36]对苹果中的JAZ家族基因也进行了分析，其表达趋势也不尽一致。本研究中在苹果的各组织中均有表达，但表达差异较大，根中表达量高，而生殖器官成熟果实中最低（图3），与Li等[36]研究的同一基因（该文章中命名为）表达略有差异，这可能与所用材料基因型差异有关。拟南芥中大量试验发现突变或过表达正常的，拟南芥并没有明显的表型[12-13]，而水稻[14,21]、大豆[23]及烟草[40-41]等粮食或经济作物中过表达均有明显表型，且各基因作用不同：水稻和过表达分别能提高水稻对盐胁迫的抗性[14]及谷粒的大小、重量等[21]；大豆中过表达能够改变植株对盐碱的敏感程度[23]；玉米中过表达导致转基因拟南芥对JA、ABA及PEG的敏感性发生变化[22]，这可能是在植物进化过程中形成功能多样性的结果。苹果是高度进化的多年生木本植物，且启动子区域包含多个激素及逆境胁迫响应元件（表2），Li等[36]研究显示家族基因能对盐胁迫、干旱及ABA等多种激素作出响应，与启动子预测结果一致。

TIFY功能域对JAZ蛋白的同源及异源互作是必需的，拟南芥共有12个JAZ蛋白，但仅有JAZ1、JAZ3、JAZ4、JAZ9蛋白既能够形成同源二聚体，又能相互作用形成异源二聚体，其余仅有个别蛋白能形成异源二聚体[37]。本研究中MdJAZ1蛋白与AtJAZ3、AtJAZ4关系最近，互作结果也类似，既可以与其自身相互作用形成同源二聚体，又可以与亲缘关系较近的AtJAZ3及AtJAZ4形成异源二聚体，但与AtJAZ9不相互作用（图5），是否MdJAZ1与拟南芥或苹果中的其他JAZ蛋白相互作用有待进一步鉴定。COI1蛋白形成的SCFCOI1复合体在感应到茉莉酸信号时能够结合JAZ蛋白，进而使其发生泛素化降解[12-13]。本研究中检测了MdJAZ1与拟南芥AtCOI1蛋白的互作关系，结果显示，在没有茉莉酸信号时，MdJAZ1与AtCOI1蛋白不发生相互作用，但在添加茉莉酸活性物质类似物冠菌素后，MdJAZ1能够与AtCOI1蛋白互作（图5），说明MdJAZ1也是SCFCOI1蛋白复合体的靶蛋白之一。下一步将构建原核表达载体，深入研究MdJAZ1蛋白的泛素化降解。

4 结论

克隆了苹果中的JAZ家族基因，ORF长为1 149 bp，编码382个氨基酸残基。DNAMan分析显示，MdJAZ1蛋白等电点为9，分子量为40.536 kDa。蛋白分析显示，MdJAZ1蛋白包含两个保守的功能域，分别是TIFY功能域及C端的Jas功能域。在苹果的根中表达量最高，且受茉莉酸及创伤诱导表达。MdJAZ1蛋白能够形成同源及异源二聚体，也可在冠菌素存在时，与F-box蛋白AtCOI1相互作用。

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（责任编辑 赵伶俐）

The Gene Expression Assays and Protein Interactions of

AN Xiu-hong, LI En-mao, LI Min, LI Zhuang, Zhang Xiu-de, Cheng Cun-gang

(Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Fruit Germplasm Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Xingcheng 125100, Liaoning)

【Objective】was isolated from apple which encoded a repressor protein in jasmonate signaling pathway. The expression ofand the interactions of MdJAZ1 with other JAZ proteins or F-box protein were determined in order to lay a foundation for further functional analysis of this gene.【Method】Thewas selected among multiple genes which were obtained through blasting in the apple genome database using the TIFY and Jas domains. The molecular weight and isoelectric point of MdJAZ1 were analyzed by the DNAMan software, and the functional domain was analyzed using the SMART soft. The phylogenetic tree of the proteins, including MdJAZ1 and the JAZ family proteins from, was constructed using the neighbor-joining (NJ) method of MEGA5.0 soft. In addition, the expression ofwas detected in different tissues of apple and with MeJA or wounding treatment using qPCR. The-acting regulatory elements of the promoter ofwere analyzed through PlantCARE database. Finally, the interactions of MdJAZ1 with other JAZ proteins and AtCOI1 were detected through the yeast two-hybrid assays. 【Result】The open reading frame (ORF) ofwas 1 149 bp in length and encoded 382 amino acids. The calculated molecular mass of MdJAZ1 was 40.536 kDa, and the isoelectric point was 9. Sequence analysis showed that MdJAZ1 protein contained the typical TIFY domain and C-terminal Jas domain. The phylogenetic relationship of MdJAZ1 was clustered with theJAZ family members AtJAZ3 and AtJAZ4. qPCR analysis revealed thatwas expressed in all apple tissues, including roots, stems, leaves, flowers and fruits, however, the transcriptional level was significantly different in the detected tissues, with the highest expression in roots and the lowest expression in fruits. In addition,was induced by MeJA and wounding treatments, with the highest expression at 1 h. Promoter analysis showed that there were multiple putative-acting elements which are involved in abscisic acid response, ethylene response, and defense and stress responses; MYB binding sites were also found in the promoter ofgene. The yeast two-hybrid assays showed that MdJAZ1 formed homo- and heterodimers and also interacted with AtCOI1 which encoded a F-box protein in.【Conclusion】was induced by MeJA and wounding treatments. MdJAZ1 protein formed homo- and heterodimers and also interacted with AtCOI1 in the present of coronatine.

apple; jasmonate;; expression; protein interaction

2016-02-03；接受日期：2016-05-02

国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-28）、辽宁省博士启动基金（201501031）、中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（0032015019）

安秀红，Tel：0429-3598126；E-mail：anxiuhong2007@126.com。通信作者程存刚，Tel：0429-3598158；E-mail：ccungang@sohu.com