刘 娜,金小伟,王业耀,,张铃松,吕怡兵,杨 琦



三唑酮对青鳉鱼和大型溞不同测试终点的毒性效应评价

刘 娜1,金小伟2*,王业耀1,2,张铃松3,吕怡兵2,杨 琦1

(1.中国地质大学(北京)水资源与环境学院,北京 100083；2.中国环境监测总站,北京 100012；3.中国环境科学研究院,环境基准与风险评估国家重点实验室,北京 100012)

以青鳉鱼和大型溞为代表性水生生物,研究三唑酮对其不同测试终点的慢性毒性效应.结果显示,以生存、生长、繁殖为测试终点,青鳉鱼的NOEC分别为76,60,5μg/L,基于大型溞蜕皮次数、生长和繁殖的NOEC分别为25,100,200μg/L.由此可见,青鳉鱼比大型溞对三唑酮的毒性更敏感.比较不同测试终点,青鳉鱼的繁殖类指标最敏感,其次是生长、生存;相比大型溞的繁殖以及幼溞的生长,其幼溞的蜕皮次数指标更为敏感.因此,低剂量长期暴露下三唑酮会对水生生物的繁殖能力造成一定的损伤,评价其水生态安全应全面考虑不同生物种群的不同测试终点,尤其是鱼类繁殖毒性效应.

三唑酮；青鳉鱼；大型溞；NOEC；慢性毒性；繁殖毒性

三唑酮()又名粉锈宁、百里通,属于内吸性杀菌剂,是甾醇脱甲基抑制剂(DMI),对小麦、玉米、果蔬、花卉等作物的上锈病、白粉病均有较高的防治效果[1],是目前应用最广泛的广谱杀菌剂之一.三唑酮不仅水溶性大(20℃时在水中的溶解度为260mg/L)[2],稳定性强(22℃时在水中的半衰期大于1年),而且具有良好移动性和易吸附,可以通过地表径流和地下水渗透进入水生环境中,在环境中持久累积[3].调查显示,三唑酮在我国的使用量有逐年增长的趋势,大量残留药物在土壤中吸附和解吸后,通过雨水的淋溶作用进入水体,造成水体污染.美国环保局(USEPA)利用暴露分析模型,估计在地表水中三唑酮的预期环境浓度为41μg/L[4].目前我国尚缺乏关于三唑酮地表水检出浓度的报道,《杂环类农药工业水污染物排放标准》(GB21523-2008)规定三唑酮原药生产企业废水处理设施总排放口的排放标准为5mg/L[5].尽管有研究显示三唑酮对生物的急性毒性毒性相对较低,属于低毒或中毒范围[4],目前的暴露水平可能不会引起水生生物的快速死亡,但急性毒性效应不能反应环境中的真实染毒情况.2006年世界自然基金会(WWF)将三唑酮列入90种具有内分泌—生殖干扰效应的农药及其代谢产物名单[6],生物在水中长期接触有可能引起除致死效应外的其他毒性效应[7-8],如子代数量减少或畸形.研究表明,三唑酮能抑制异戊烯途径衍生物—植物内源激素赤霉素(GA)的生物合成,改变植物激素的平衡,从而调节植物的生长和发育[9],表现出抑制浮萍的根系生长和个体繁殖[10].然而目前对三唑酮慢性毒性效应的研究较少,且主要集中在哺乳动物和陆生植物,对水生生物的研究相对匮乏.

由于有毒物质的生物毒性效应因试验材料的不同而存在较大差异[11],大部分国家规定在进行水生态风险评价或水质基准推导时需要多种水生物种的慢性毒性值[12],例如,USEPA要求8种以上不同物种(三门八科)的最大可接受浓度值,OECD要求至少5种不同种类物种的慢性无观察效应浓度(no observed effect concentration, NOEC).此外,在对三唑酮所产生的环境效应进行评估时,污染物效应评估是进行危害认定和风险水平判别的重要部分,而选择合适的毒性评估终点是准确评估的关键[13].因此,进一步研究三唑酮对不同生物类群的影响,筛选出具有代表性的效应终点是十分必要的.浮游动物和鱼类是水域生态系统的重要组成部分,研究浮游动物和鱼类在三唑酮暴露水体中的生理生态变化,对科学评估水域生态系统健康具有重要的意义.青鳉鱼()和大型溞()对水质、环境变化特别敏感,是国际上通用的标准模式生物,广泛应用于生态毒理学研究的各个方面[14],在推导水生态基准时可以赋予和本土物种相同的权重.

本研究以三唑酮为测试物质,以国际通用模式生物青鳉鱼和大型溞为代表性水生生物,主要进行了对青鳉鱼的28d慢性毒性试验和大型溞的21d慢性毒性试验.研究三唑酮对不同生物类群及不同测试终点的慢性毒性效应,包括对青鳉鱼幼鱼的生存和生长、成鱼的繁殖、大型溞F0代21d慢性毒性(体长、蜕皮次数、生小溞数)以及F1代生存的影响.旨在通过慢性NOEC值来评价三唑酮对青鳉鱼和大型溞毒性效应的影响,并为后续将要进行的三唑酮对水生态系统的风险评价提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 试验试剂

三唑酮溶液标准样品,CAS登记号:- 43-3,购于景宏化工有限公司,浓度为100mg/L.助溶剂丙酮(<0.1mL/L),购于天津津北精细化工有限公司.试验过程所用稀释水为去氯自来水(曝气48h),各水质参数如下: pH=7.65,总有机碳(TOC)为0.017mg/L,硬度(以CaCO3计)约为140mg/L.试验过程中溶解氧平均水平维持在80%饱和度以上.配制不同浓度水平(即名义浓度)的试验液,并对三唑酮含量进行测定实测浓度为名义浓度的98.2%,空白对照中未检出三唑酮.因此,在后续慢性毒性试验中本试验采用名义浓度来表示三唑酮的毒性结果[15].

1.2 试验生物

青鳉鱼()和大型溞()均来自中国科学院生态环境研究中心,已经在本试验室实现小规模繁殖和养殖.青鳉鱼采用流水试验,每24h流量为试验容器容积的6倍[16],试验前在试验条件下驯化至少两周.试验条件设定为:温度(24±1)℃,溶解氧6mg/L以上,pH 7.24±0.16,光/暗周期为16h:8h(光照:黑暗),试验期间每天早晚喂食新鲜丰年虾一次.鱼卵孵化试验为半静态试验,每24h换水一次,孵化液配方为: 1mL NaCl (10%), 1mL KCl (0.30%), 1mL CaCl2· 2H2O (0.40%), 1mL MgSO4·7H2O (1.63%), 1mL亚甲基兰(0.01%),95mL蒸馏水,使用前混合[17].

大型溞为实验室培养3代以上的单克隆品系,个体间差异较小,使用Elendt M4培养基进行培养,用新鲜斜生栅藻()作为唯一的食物.斜生栅藻按照经济合作与发展组织(Organization for Economic Co-operation and Development, OECD) 201[18]的要求配制培养基培养.按照OECD 211[19]的培养条件,大型溞和斜生栅藻都置于恒温水浴培养箱中,温度为(22±1)℃,每天光照16h,黑暗8h,光照强度不超过1110l~ 1480lx[15~20μE/(m2·s)].实验前,挑选个体大、怀卵多和游泳能力强的母溞20~30只置于500mL的烧杯内,喂养3周,随机选取小于24h的非头胎幼溞用于慢性毒性实验.幼溞置于盛有40mL M4培养基的50mL烧杯中,每天喂食斜生栅藻,投饵密度为2.0×105~3.0×105cells/mL.

1.3 青鳉鱼试验设计

1.3.1 96h急性致死试验 96h急性毒性测试参照OECD制定的急性毒性标准试验方法[20].试验用鱼为生命早期处于指数生长期的青鳉鱼幼鱼,每个容器中5L试验用水,10条幼鱼.参考文献中三唑酮对鱼类急性半致死浓度(LC50)的数值[21],试验浓度设置为500,1000,2000,3000,4000, 8000μg/L,每24h 观察一次,记录死亡情况,及时清除死亡的幼鱼和代谢物.

1.3.2 青鳉鱼幼体生长抑制试验 青鳉鱼幼体生长抑制试验采用生命早期处于指数生长阶段的幼鱼,根据30d预测生存毒性计算结果,设置试验浓度为20,40,60,80,100μg/L,每天观察并记录幼鱼生长死亡情况,及时清除死亡的幼鱼和代谢物.暴露28d后统计存活数量,测量幼鱼的体重,并计算幼鱼的比生长率(SGR),计算公式[22]如下:

式中:1,2为试验开始与结束的时间间隔;1,2分别表示某尾鱼在1,2时的重量.

1.3.3 青鳉鱼繁殖试验 采用丙酮作为助溶剂,设置1个空白对照组和1个丙酮最大浓度(0.01%) 对照组,以及5个浓度水平,分别为:1,5,10,25, 50μg/L.采用4个月的成年青鳉,持续暴露28d,最后4d每天记录每组鱼的产卵量和受精率.收集受精卵,在胚胎开始分裂前(受精后30min内)放入孵化液,进行半静态暴露孵化试验,孵化液每24h更新一次[23].记录每组鱼全部孵出的时间,试验结束时计算孵出率.受精卵死亡标志为卵凝结(coagulation)、(tail not detached)、无体节(no somites)、无心跳(no heart-beat)[24]. 最后以产卵量、受精率、孵化时间和孵化率为测试终点,评价三唑酮对青鳉鱼的繁殖毒性效应.

1.4 大型溞试验设计

大型溞21d慢性毒性试验参考OECD 标准方法[19],试验为半静态试验,每24h更换试验液一次.试验设置1个空白对照组和5个浓度梯度,每个试验浓度10只亲溞,单独分开培养,每天喂食斜生栅藻浓缩液2次.通过查阅文献[25]和一系列预实验,实验浓度设置为25,50,100,200, 400μg/L.取40mL用M4配制(pH 7.8±0.2)的试验溶液放入50mL烧杯中,每个烧杯中放入1只小于24h的非头胎幼溞.记录每只大型溞的蜕皮次数、每胎产溞数量及幼溞存活个数(死亡鉴定:摇动玻璃管观察底部幼溞15s未能游动即认定死亡),及时取出新生幼溞,暴露试验结束时在显微镜下测量大型溞体长(不包括尾刺).

1.5 数据统计分析方法

根据96h急性致死试验数据,利用US EPA 开发的软件ACE 2.0[26]计算30d慢性致死浓度.用=0.05的单侧假设检验[27],将试验浓度组的有害效应与对照组相比,确定每个测试终点的NOEC. NOEC值为与对照组相比其生长速率无显著性差异(>0.05)的最高浓度.

2 结果与讨论

2.1 青鳉鱼幼体生存/生长抑制试验结果

绘制处理浓度对死亡率的曲线,用直线内插法计算出三唑酮对青鳉鱼的半致死浓度(LC50),并用标准方差方法计算95%的置信限,最后用US EPA开发的软件ACE 2.0[26]推算慢性生存毒性数据,得到死亡率分别为1.00%、0.10%和0.01%的时间—致死浓度曲线(图1).

青鳉鱼生命早期阶段幼鱼经过28d的三唑酮暴露以后,以生长抑制作为测试终点,结果如图2所示.

经过统计分析,对照组中幼鱼的比生长速率为9%,三唑酮的浓度为80,100μg/L时,幼鱼的比生长速率分别为7.75%,7.32%,相对于对照组受到显著抑制作用(<0.05).因此,青鳉鱼生命早期阶段的28d生长毒性NOEC值为60μg/L, LOEC值为80μg/L.

2.2 青鳉鱼繁殖毒性试验结果

青鳉鱼成鱼暴露26d后开始记录每天的产卵量和受精率,连续记录4d,计算每个试验浓度组平均产卵量和平均受精率.将每组的受精卵在孵化液中进行暴露孵化,每24h换孵化液一次,及时清除死亡的受精卵,记录每组全部孵出时间,并计算孵出率,结果如图3所示.

经过统计分析,对照组中青鳉鱼的产卵量为135.25±11.9,三唑酮的浓度为10,25μg/L时,产卵量分别为86.75±20.8、87±14.8,与对照组相比受到显著抑制作用(<0.05);三唑酮浓度为50μg/L时,青鳉鱼产卵量为61.5±9.8,抑制作用更加显著(<0.01).与产卵量相似,孵化率在10μg/时表现出显著差异(<0.05),50μg/L时差异性增大.相对于产卵量与孵化率,鱼卵受精率敏感性较差,25μg/L时开始表现出显著差异(<0.05).4个繁殖指标中,鱼卵孵化时间最不敏感,在所有试验浓度中,青鳉鱼卵孵化时间与对照组相比无显著差异(> 0.05).由此可见,产卵量和孵化率是评价三唑酮对青鳉鱼繁殖毒性效应最敏感的生物标志物, NOEC均为5μg/L.为缩短实验时间,降低试验操作难度,建议产卵量作为青鳉鱼繁殖毒性指标.

2.3 大型溞慢性毒性试验结果

从图4可以看出,三唑酮浓度£100μg/L时,与对照组相比,大型溞体长没有明显差异;在三唑酮浓度为200,400μg/L的环境中,大型溞体长显著短于对照组(<0.01).图5表明,大型溞蜕皮次数随着三唑酮浓度的升高逐渐减少,在50μg/L时与对照组相比显著减少(<0.05),说明三唑酮能有效地与大型溞体内的蜕皮激素受体结合,从而干扰其正常的生理过程.

大型溞21d染毒过程中每只亲溞产胎6次,表1中列出了每胎产溞数和幼溞死亡情况.

表1表明,21d暴露过程中,第1次产溞数较多,第2次略有降低,对照组和低浓度暴露(25~ 100μg/L)情况下,单次产溞量降低后又逐渐增加.在较高浓度(200~400μg/L)下,大型溞的生殖量随着暴露时间逐渐降低.观察21d产溞总数,三唑酮浓度为25,50μg/L时与对照组差别不大,浓度为100~200μg/L时累积产溞数少于对照组,但无显著差别(P>0.05),400μg/L时累积产溞数显著降低(P<0.05). Hassold等[25]在相似条件下进行大型溞繁殖毒性试验,结果表明以大型溞繁殖量为测试终点的EC10为611μg/L,与本试验结果相差不大.因此,三唑酮对大型溞的繁殖毒性NOEC可以确定为200μg/L.三唑酮浓度为0~100μg/L时,幼溞无死亡现象,当浓度提高到200、400μg/L时,死亡率为12.5%,可见,三唑酮浓度大于200μg/L时能够明显降低大型溞的子代存活率,由此推断以F1代幼溞死亡为测试终点的NOEC为100μg/L.

注:“*”表示显著性差异为<0.05.

2.4 三唑酮水生态毒性

如表2所示,以生存、生长、繁殖毒性为测试终点,青鳉鱼的NOEC分别为76,60,5μg/L;以大型溞F0代蜕皮次数,生长和繁殖为测试终点的NOEC分别为25,100,200μg/L.

比较不同测试终点,针对大型溞其幼溞的生长以及蜕皮次数相比繁殖指标更为敏感,而青鳉鱼的繁殖类指标最敏感,其次是生长,生存.这是因为,青鳉鱼与大型溞具有不同的内分泌调节系统,三唑酮在其体内发生的作用模式不同,进而表现出不同的毒性效应.作为脊椎动物,青鳉鱼的繁殖系统受下丘脑-垂体-甲状腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴控制[30],刘少颖[31]研究表明三唑酮低浓度长期暴露能够产生甲状腺激素干扰效应和芳香酶抑制效应,影响青鳉鱼繁殖和胚胎发育.此外,由于产卵量与鱼类的卵子发育,雌雄交配行为,性激素刺激等多个繁殖环节相关,是所有相关生理生化行为的综合体现,因此对外源化合物的影响最敏感.

表2 三唑酮对青鳉鱼和大型溞不同测试终点的NOEC值 Table 2 The NOEC values with different endpoints for Oryzias latipes and Daphnia magna

分析不同生物类群对三唑酮的毒性效应,表2表明青鳉鱼比大型溞更敏感.据报道,三唑酮对斑马鱼和稀有鮈鲫的96h LC50分别为13100μg/L 和6890μg/L[22],对非洲爪蟾48h 急性致死NOEC为g/L[32],而三唑酮对浮萍的96h半抑制浓度(IC50)为5370μg/L[10],对栅藻的96h 半效应浓度(EC50)为2770μg/L[33],说明不同生物类群对三唑酮的敏感性有明显差异,鱼类比两栖类敏感,而浮萍和藻类的急性毒性比鱼类更敏感.因此,作为除草剂类农药,在制定三唑酮水质基准时,只有动物慢性毒性数据不足以保护整个水生态系统,有必要进一步研究三唑酮对水生植物,藻类以及其它生物类群的慢性毒性效应.

3 结论

3.1 根据慢性毒性试验结果,青鳉鱼的NOEC为5~76μg/L,大型溞的NOEC为25~200μg/L,青鳉鱼比大型溞对三唑酮更敏感.

3.2 分析不同测试终点的敏感性,青鳉鱼的繁殖毒性最敏感,其次是生长、生存;大型溞的蜕皮次数最敏感,其次是生长和F1代生存,三唑酮对F0代大型溞的繁殖力影响相对较小.

3.3 三唑酮对不同生物类群和不同测试指标的敏感性存在较大差异,在预测低浓度水体的生态风险时,应全面考虑不同生物类群的不同测试终点,尤其要考虑鱼类繁殖毒性效应.

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* 责任作者, 高级工程师, jxw85@126.com

Toxicity effect of Triadimefon based on Oryzias latipes and Daphnia magna with different test endpoints

LIU Na1, JIN Xiao-wei2*, WANG Ye-yao1,2, ZHANG Ling-song3, LV Yi-bing2, YANG Qi1

(1.School of Water Resources and Environment, China University of Geosciences (Beijing), Beijing 100083；2.China National Environmental Monitoring Center, Beijing 100012；3.State Key Laboratory for Environmental Criteria and Risk Assessment, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China).Science, 2016,36(7)：2205~2211

Triadimefon is one of the most widely used broad spectrum bactericides at the present. Although the acute toxicity of triadimefon is lower, it would accumulate persistently in the water environment and cause adverse effect to aquatic organisms due to its consistency and adsorption. Sub-chronic toxicity of different endpoints for Oryzias latipes and Daphnia magna were conducted to evaluate aquatic ecological effect of triadimefon. The result showed that the NOECs of triadimefon based on the survival, growth and reproductive of Oryzias latipes were 76, 60, 10μg/L respectively. While the NOECs based on the molt, growth and reproductive of Daphnia magna were 25, 100, 200μg/L, respectively. Oryzias latipes was more sensitive than Daphnia magna to triadimefon. For the view of different endpoints, reproduction was the most sensitive endpoint of Oryzias latipes to triadimefon, followed as growth and survival. For Daphnia magna, the growth and molt were more sensitive than reproduction. Therefore, it would cause reproductive fitness to aquatic organisms under low dose long-term exposure of triadimefon. Different endpoints for kinds of species, especially for reproductive toxicity of fish should be considered in the ecological risk assessment of triadimefon.

triadimefon；Oryzias latipes；Daphnia magna；NOEC；chronic toxicity；reproductive toxicity

X171.5

A

1000-6923(2016)07-2205-07

刘 娜(1985-),女,河北衡水人,中国地质大学(北京)博士研究生,主要研究方向为生态毒理以及区域生态风险评价.

2015-12-24

国家自然科学青年基金(21307165);国家水体污染控制与治理科技重大专项(2013ZX07502001);环境模拟与污染控制国家重点联合实验室(中国科学院生态环境研究中心)开放基金(14K02ESPCR)