孟凡东，李妍，吴迪，蒋涛，王扬，隋承光，姜又红

（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所二室，沈阳 110001）

·论著·

Wnt/β-catenin信号通路中Wnt基因对肾癌细胞的生物学影响

孟凡东，李妍，吴迪，蒋涛，王扬，隋承光，姜又红

（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所二室，沈阳 110001）

目的探讨Wnt基因对肾透明细胞癌Caki-2细胞的生物学影响。方法细胞分3组：Caki-2组（空白对照）、shRNA+ Wnt+Caki-2组（慢病毒沉默Caki-2细胞中的Wnt基因）、空载体组（实验对照），CCK-8法观察不同时间各组细胞的增殖情况；透射电镜观察沉默Wnt基因对Caki-2细胞凋亡的影响；Transwell小室方法检测各组细胞侵袭能力的变化；实时PCR观察Wnt/ β-catenin信号通路中下游基因的变化和凋亡相关基因的变化。结果shRNA+Wnt+Caki-2组出现了细胞增殖抑制，其增殖能力与其他2组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。shRNA+Wnt+Caki-2组表现出明显的细胞凋亡变化，出现凋亡小体。侵袭实验显示，shRNA+Wnt+Caki-2组迁出的细胞数明显低于其他2组（P＜0.05）；shRNA+Wnt+Caki-2组中Wnt mRNA、β-catenin mRNA 和Bcl-2mRNA的表达水平均低于其他2组（P＜0.05）。结论慢病毒沉默Wnt基因，影响了肾透明细胞癌Caki-2细胞的增殖，促进了细胞的凋亡，抑制了Caki-2细胞的侵袭。

肾癌；Wnt；β-catenin；Bcl-2

肾细胞癌是肾脏最常见的原发性恶性肿瘤，占肾脏原发性恶性肿瘤的90%，居我国泌尿生殖系统肿瘤的第二位。目前，根治性肾切除是治疗肾细胞癌的最有效手段，但行肾切除术的患者有40%最终复发。因此，寻找有效的治疗药物成为首要的难题。Wnt/β-catenin信号通路因其作用的广泛性，成为近年来的研究热点。Wnt/β-catenin信号与多种疾病密切相关，疾病的发生往往与细胞的死亡方式有着密不可分的关系，细胞死亡方式的不同对疾病也有不同的影响。本研究拟利用RNA干扰技术，探讨Wnt信号通路在肾细胞癌增殖及凋亡中的作用。

1　材料与方法

1.1细胞系

肾癌Caki-2细胞购自昆明细胞库。

1.2主要试剂

McCoy’s 5A培养基（美国HyClone公司），胎牛血清、胰酶（美国GIBCO公司），CCK-8试剂盒（中国凯基公司），实时PCR试剂盒（日本Takara公司），Matrigel（美国BD公司），抗体Bcl-2、β-catenin和HRP标记羊抗鼠IgG（美国Sigma公司），慢病毒构建针对Wnt设计的shRNA载体由上海基尔顿公司合成。

1.3细胞培养和分组

Caki-2细胞用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基进行培养，放置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，倒置显微镜下观察，3～4 d换液1次，待细胞长至75%左右密度时，用胰酶消化，按1∶3进行传代，继续培养，部分-80℃保存，以备用。细胞分3组：Caki-2组，培养的Caki-2细胞中不加处理因素，作为空白对照；shRNA+Wnt+Caki-2组，用构建的慢病毒载体转染Caki-2细胞沉默细胞中的Wnt基因，为实验组；空载体组，用空的慢病毒载体转染Caki-2细胞，作为实验对照。

1.4细胞增殖

细胞培养至75%左右密度时，用胰酶进行消化，细胞计数，按每孔1×104/mL接种于96孔板中。每组细胞设置3个复孔。培养12、24、48 h后，每孔加10 μL CCK-8试剂，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，2 h后酶标仪测定450 nm波长的光度值。

1.5细胞凋亡

电镜观察细胞的凋亡情况，取对数生长期的细胞按4×105/mL接种于6孔板中，48 h后胰酶消化细胞，1 000 r/min、4℃离心8 min，冷Palade缓冲液洗涤3次，将细胞悬浮于1%的锇酸中，4℃固定1 h，Palade缓冲液洗涤3次，将细胞悬浮于1%的锇酸中，固定1 h。用丙酮梯度脱水，再将细胞置于丙酮/包埋剂（1∶1）中置换30 min。包埋剂浸润2 h后，将细胞进行包埋、切片、醋酸铀及枸橼酸铅染色。电镜下观察细胞形态的变化。

1.6细胞侵袭

取对数生长期的各组细胞，用无血清培养基将细胞按密度为每孔2×105/mL接种于Transwell小室的上室，下面的小室中加入500 μL 20%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基，置于37℃培养箱中，24 h后取出Transwell小室，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，显微镜观察，计数细胞。

1.7相关基因的表达

收集对数生长期的不同组细胞，依据PCR试剂盒的说明书进行总RNA的提取，测其浓度，保证OD260/280比值在1.8～2.0之间才可以进行后续实验。由大连生工生物工程公司进行引物的设计和合成。Wnt：F，5′-GGTTCCATCGAATCCTGCA-3′，R，5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′；Bcl-2：F，5′-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3′，R，5′-TGCATAT TTGTTTGGGGCAGG-3′；β-catenin：F，5′-AAAGCGG CTGTTAGTCACTGG-3′，R，5′-GACTTGGGAGGT ATCCACATCC-3′；GAPDH：F，5′-TGTTGCCATCAA TGACCCCTT-3′，R，5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。总反应体系及条件：50 μL，95℃预变性5 min，90℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环。将目的基因值与参照基因值进行比值计算，得到Wnt mRNA、Bcl-2 mRNA、β-catenin mRNA的相对含量。

1.8统计学方法

2　结果

2.1沉默Wnt基因对肾癌Caki-2细胞增殖的影响

为观察Wnt基因对Caki-2细胞增殖的影响，采用CCK-8法观察各组细胞的增殖能力。结果显示，作用48 h后，shRNA+Wnt+Caki-2组细胞增殖能力（0.390 0±0.005 5）明显受到抑制，与Caki-2组（0.730 0± 0.004 7）和空载体组（0.670 0±0.006 4）相比，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图1。

2.2沉默Wnt基因对肾癌Caki-2细胞凋亡的影响

透射电镜观察沉默Wnt基因后各组Caki-2细胞的凋亡情况。在电镜下可以观察到，凋亡细胞的细胞质出现浓缩，内质网与细胞膜融合形成空泡，线粒体的体积增大，细胞核变小，染色质高度浓缩并凝结成块，可观察到凋亡小体的出现，shRNA+Wnt+ Caki-2组细胞出现的凋亡小体更加明显。见图2。

2.3沉默Wnt基因对肾癌Caki-2细胞侵袭的影响

利用Transwell小室方法验证沉默Wnt基因对Caki-2细胞侵袭能力的影响，结果显示：shRNA+ Wnt+Caki-2组细胞（29±8）与Caki-2组细胞（53±6）和空载体组细胞（49±8）的侵袭能力相比，穿过Transwell小室膜的细胞数明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图1　CCK-8法检测各组Caki-2细胞增殖能力的变化Fig.1　The cell proliferation of Caki-2 cells in each group detected by CCK-8

图2　电镜观察各组Caki-2细胞的凋亡情况Fig.2　The Caki-2 cell apop tosis in each groups observed under electron m icroscope

2.4沉默Wnt基因对相对基因表达的影响

实时荧光定量PCR法检测沉默Wnt基因后各组Caki-2细胞中相关基因表达的情况。实验结果显示，shRNA+Wnt+Caki-2组与其他2组相比，Wnt mRNA和β-catenin mRNA的表达水平明显减低，差异有统计学意义（P＜0.05）。shRNA+Wnt+Caki-2 组Bcl-2mRNA的水平低于其他2组（P＜0.05），但Caki-2组和空载体组比较无统计学差异（P＞0.05）。见图4。

图3　各组Caki-2细胞侵袭穿膜情况Fig.3　The Caki-2 cell invasion assay and staining of the transmembrane ce lls of each groups

3　讨论

Wnt蛋白是一类富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，脊椎动物中已发现至少19种，在细胞分泌液中可以检测到一些含有糖基化N末端的Wnt蛋白，提示Wnt蛋白的分泌在细胞内受到高度的调控。Wnt信号通路是一条在进化上相对保守的信号途径，它有着广泛的生物学效应，对个体发育、细胞分化、凋亡和坏死等有着重要影响，对生命体大多数生物学现象都有调控作用。有文献［1］指出，某些细胞中Wnt/β-catenin信号通路可促进细胞的凋亡，在大多数良性黑色素痣中发现存在β-catenin，一旦βcatenin的含量下降，将会导致良性黑痣向恶性黑色素瘤发展。肿瘤的发生发展常与细胞异常生长密切相关，并伴随癌基因的激活、抑癌基因的失活、细胞周期调控紊乱和表观遗传学改变等多方面机制的改变［2］。

图4　沉默W nt基因对Caki-2细胞基因表达的影响Fig.4　The influence of Wnt gene silencing on gene expression in Caki-2 cells

肾细胞癌中85%为透明细胞癌，其他类型比较少见，因此本研究选用Caki-2细胞作为实验细胞。本研究通过慢病毒沉默Wnt基因的表达，观察了Caki-2细胞的增殖、凋亡的变化。研究结果显示，沉默Wnt基因组的细胞增殖率明显下降。对Wnt信号通路中Wnt蛋白这一非常重要的启动因子进行抗原抗体反应，从而抑制Wnt蛋白与胞膜受体结合，引起了细胞增殖的改变。

也有研究［3］认为，细胞在缺氧复氧处理过程中激活Wnt/β-catenin信号能显著增加caspase-3的活性，即促进了细胞的凋亡。为了观察Wnt基因对肾癌Caki-2细胞凋亡的影响，本研究应用透射电镜观察了沉默Wnt基因后各组细胞凋亡的变化，shRNA+ Wnt+Caki-2组细胞的细胞质出现明显的浓缩，内质网与细胞膜融合形成空泡，线粒体的体积增大，细胞核变小，染色质高度浓缩并凝结成块，可观察到凋亡小体的出现。

Bcl-2是细胞凋亡重要的调控基因。本研究又通过实时PCR法检测了Bcl-2mRNA的表达情况，发现沉默Wnt基因的肾癌细胞组Bcl-2mRNA的表达水平明显降低。有研究［4～6］显示，肿瘤组织中Bcl-2的过表达与乳腺癌、肠癌和肺癌的预后呈正相关，但本研究的结果与其存在一定的差异，有可能是肿瘤组织类型不同，或是肿瘤组织和肿瘤细胞系中Bcl-2的表达也会存在差异。β-catenin是细胞质中一种重要的多功能蛋白，具有介导细胞黏附及参与Wnt信号传导的双重功能［7］。本研究发现，shRNA+Wnt+ Caki-2组β-catenin mRNA的表达量也高于其他2组。β-catenin由胞质向胞核的转位被认为是该信号通路被激活后行使功能的标志［8］。当Wnt/β-catenin信号传导通路活化异常时，下游靶基因的异常表达使细胞增殖增快，引起蛋白质异常表达，导致细胞癌变加速［9］。

肿瘤的浸润与转移是一个多步骤的复杂过程，涉及细胞从原发灶脱落浸润穿透基底膜降解细胞外基质和远处转移。本研究证实，Wnt/β-catenin信号通路在肾癌细胞的增殖及凋亡中发挥重要作用，为了进一步研究该信号通路的作用，采用Transwell小室方法观察了沉默Wnt基因后，各组细胞侵袭能力的变化。研究结果显示，沉默Wnt组的Caki-2细胞表现出明显的侵袭能力受到抑制。

肿瘤中异常Wnt信号转导的研究还处于探索阶段，有许多问题尚不清楚。本研究通过干扰Wnt/βcatenin信号通路中的Wnt蛋白，观察了肾癌Caki-2细胞的变化，发现沉默Wnt基因后细胞增殖受到抑制，促进了细胞的凋亡，侵袭能力也受到限制。肾癌的发生发展是由多因素导致、多基因参与、多步骤形成的复杂病理生理过程。选择合适的药物和有效的治疗手段对于肾癌患者至关重要。综上所述，本研究为肾癌的药物研发及治疗靶点提供了一定的理论依据。

［1］Sinnberg T，Menzel M，Ewerth D，et al.β-Catenin signaling increases during melanoma progression and promotes tumor cell survival and chemoresistance［J］.PLoS One，2011，6（8）：e23429.

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（编辑陈姜）

BiologicalEffectsof Wnt inW nt/β-catenin Signaling Pathway on Kidney Cancer Cell

MENG Fan-dong，LI Yan，WU Di，JIANG Tao，WANG Yang，SUI Cheng-guang，JIANG You-hong
（Second Laboratory of Tumor Research Institute，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the biological effects of Wnt gene in kidney cancer Caki-2 cells.M ethodsThe Wnt gene was silenced in kidney cancer Caki-2 cells by lentivirus vector.The cell proliferate ability of cells in each group were assayed by CCK-8 kit at different time points. TheapoptosisofCaki-2 cellswasobserved aftersilencing Wnt geneby transmission electronmicroscope.The invasion abilityofeach group cellswas tested using Transwell chambers.The genes expression changes of Wnt/β-catenin signaling pathway and apoptosis related gene were determined by realtime PCR.ResultsCompared with the other two groups，the cell proliferate ability of the cells after silencing Wnt gene was suppressed，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Apoptosis increased significantly in shRNA+Caki-2+Wnt group cells with silencing of Wnt gene，and apoptotic body appeared in these cells.In invasive experiment，the number of emigrated cells in shRNA+Caki-2+Wnt group were significantly lower than other groups（P＜0.05）.The expression of Wnt mRNA，β-catenin mRNA and Bcl-2mRNA in shRNA+Caki-2+Wnt group cells was lower than other groups（P＜0.05）.ConclusionSilencing of Wnt gene of kidney cancer Caki-2 cells can affect the proliferation rate of the cells，promote the cell apoptosis，and inhibit the invasion ability，which provide certain theoretical basis for the research and development of new drugs and new therapeutic targets.

kidney cancer；Wnt；β-catenin；Bcl-2

·论著·

R730.23

A

0258-4646（2016）04-0289-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.04.001

国家自然科学基金（81202955）；辽宁省教育厅高校重点实验室支持计划项目（LS2010170）

孟凡东（1970-），男，副教授，博士. E-mail：dd528@126.com

2015-12-02

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