陕西省疾病预防控制中心(西安710054)

石　一　张　铮　张　义　马国柱　刘长宏　陈　飒　刘　峰　刘东立▲



志贺菌实验室快速分子检测与分析*

陕西省疾病预防控制中心(西安710054)

石一张铮张义马国柱刘长宏陈飒刘峰刘东立▲

目的：探讨群体性感染性腹泻的发生病因。方法：采用试剂盒和多重PCR的方法进行快速检测。结果：核酸结果显示志贺菌阳性， ipaH毒力基因阳性。结论：此次感染是一起由志贺菌引起的痢疾暴发疫情，多重PCR方法相比传统细菌培养的方法更加快捷。

主题词腹泻/病因学腹泻/诊断志贺菌属/诊断聚合酶链反应@快速检测

2015年10月中旬，陕西省彬县某幼儿园多名儿童出现发热、腹泻、腹痛、恶心、呕吐、头痛等症状，先后28例儿童入院，其中1例儿童症状较重入住小儿ICU，经过现场流行病学调查、临床诊断和实验室检测，怀疑此次疫情可能是由志贺菌引起的一起细菌性痢疾暴发，现将实验室检测结果分析报告如下。

材料与方法

1标本与试剂

1.1标本来源：共收集标本22份，其中病人标本10份，环境标本12份。

1.2试剂来源：Mac平板购自梅里埃生物制品有限公司，GN生化鉴定卡由法国梅里埃公司生产，核酸提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，韩国Seeplex腹泻多重PCR试剂盒购自杭州纽罗西敏生物科技有限公司，DNA引物委托上海生工合成。

1.3 仪器：法国梅里埃公司VITEK2全自动生化分析仪。

2方法

2.1常规培养：将所有标本接种Mac平板，36℃培养24h，挑取可疑菌落，进行生化试验。生化分析采用法国梅里埃公司VITEK2全自动生化分析仪进行分析。

2.2核酸提取：核酸提取使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行实验，提取方法按照说明书进行。

2.3Seeplex腹泻多重PCR检测：首先使用Diarrhea-B1 ACE Detection试剂盒对所提核酸进行多重PCR扩增，实验方法参照说明书，然后对扩增产物使用2%琼脂糖进行电泳检测，电压120V，电泳时间1h。

2.4志贺菌毒力基因检测：委托上海生工合成志贺菌SET1、SET2、ial、ipaH毒力基因PCR引物，具体引物序列[1]见表1。PCR反应采用25μl扩增体系，模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，2×Taq MasterMix 12.5μl，ddH2O补至25μl。四种毒力基因PCR循环参数相同，95℃ 5min，95℃ 50s，56℃ 50s，72℃

表1　志贺菌4种毒力基因引物序列

60s，30个循环，72℃ 7min[1]。扩增产物使用1%琼脂糖进行电泳检测，电压120V，电泳时间30min。

结　果

1现场流行病学调查结果本次流行病学调查44例，其中男24例，女20例，男女比例为1.2∶1。发病年龄3～6岁，发病最多年龄的是5岁(61.36%)。病例多集中在二楼厕所周围的3个班级，罹患率分别为17.54%、15.38%、24.56%，该楼层没有流水洗手设施。首例病例的发病时间为12日上午8时，15日晚病例数迅速增加，16日8时至16时达发病高峰，17日病例数开始迅速减少，病例主要集中在16日。

2分离培养结果可疑菌落经VITEK2生化鉴定均为大肠埃希菌，未分离到志贺菌。

3试剂盒检测结果对部分病人和环境标本采用Seeplex腹泻病多重PCR试剂盒检测结果显示：4份病人标本志贺菌核酸阳性，2份环境标本志贺菌核酸阳性(包括1份便池标本和1份洗手盆标本)。见图1～2。

图1Diarrhea-B1 ACE Detection试剂盒PCR扩增结果(1～9患者，10～13环境)

图2Diarrhea-B1 ACE Detection试剂盒PCR扩增结果(1～9环境)

4毒力基因检测结果挑取部分病人和环境标本进行志贺菌毒力基因检测，结果显示：上述4份病人标本均扩增出志贺菌ipaH基因条带，其中2例病人同时扩增出SET1基因条带，还有1例病人扩增出混合条带(15号)。见图3。

图34种毒力基因PCR扩增结果(1～4，15患者，5～14环境)

讨　论

志贺菌为革兰阴性杆菌，胞内致病，具有高度的传染性危害严重。据2011年中国重点传染病和病媒生物监测报告的统计，2011年全国共报告细菌性痢疾病例236321例，死亡23例，发病率17.62/10万，病死率0.0096%。陕西省2011年报告的痢疾病例数为9559例，死亡1例，病死率0.01%，发病率高居法定甲、乙类传染病报告前三名，严重的影响了人们的生产生活。该菌主要危害儿童，尤其是5岁以下的幼儿，病死率3%～ 5%。

志贺菌是由一个环状染色体和环状大质粒组成的，其上含有的毒力基因决定了志贺菌的致病性[2]，ipaH 基因、SET 1 基因、SET 2 基因、ial 基因已经确定与人类疾病相关。ipaH 基因一般被用来鉴定志贺菌。ial位于大质粒上一般与侵袭性相关。SET 1和 SET 2是两种常见的志贺氏菌肠毒素，SET 1热稳定，SET 2部分能与志贺肠毒素的抗血清发生中和。本次实验4例病人均扩增出了ipaH基因条带，与韩国Seeplex腹泻病多重PCR试剂盒的结果一致，其中2例同时扩增出SET1基因条带，还有1例扩增出SET1基因，但未扩增出ipaH基因条带。未扩增出ipaH基因条带的病人标本有待我们进一步的分析。而对于环境标本，Seeplex腹泻病多重PCR试剂盒检测出两份志贺氏菌核酸阳性，但毒力基因检测并未扩增出任何条带，可能是由于引物设计的不同。

传统细菌培养的方法一直被认为是确定病原菌的金标准。然而现在由于抗生素的大量使用，很多标本很难分离培养出真正的病原菌。随着 PCR技术的出现，尤其是荧光定量PCR技术的出现[3]，弥补了很多传统实验方法上的不足，而且更加便捷。感染性腹泻是突发公共卫生事件中最常见的一种，如何快速确定病因至关重要，现在针对各种病原菌的商用PCR检测试剂盒，荧光定量PCR检测试剂盒非常多，检测的毒力基因各不相同，灵敏度差异也很大，如何既能提高我们的检测效率，又能准确确定病因，是我们亟待思考的问题。

[1]胡守奎，胡万富，王敏，等. 安徽省2008-2010年宋内氏志贺菌分子流行病学分析[J].中华疾病控制杂志，2013，17(11)：959-962.

[2]冉丹丹，于学辉，宋定州，等.志贺菌毒力相关因子研究现状[J].西南民族大学学报自然科学版，2012，38(3)：390-395.

[3]Xia S，Xu B，Huang L，etal. Prevalence and characterization of human shigella infections in Henan province，China，in 2006[J].Clin Microbiol，2011，49(1) : 232-242．

(收稿：2016-06-10)

Rapid detection and analysis in an outbreak of infectious diarrhea caused by Shigella spp

Shaanxi Province Center for Disease Control and Prevention(Xi’an 710054)

Shi YiZhang ZhengZhang Yi et al

Objective: To analysis the cause of an outbreak of infectious diarrhea in Binxian County, Xianyang.Methods: Cultured according to the GB4789.5-2012, meanwhile Seeplex kit and the method of multiplex PCR was used for rapid detection.Results: Nucleic acid showed Shigella virulence gene positive ipaH positive.Conclusion: The outbreak was caused by Shigella spp.Seeplex and the multiplex PCR method compared with the traditional bacterial cultured method are more efficient.

Diarrhea/etiologyDiarrhea/diagnosisShigella/diagnosisPolymerase chainreaction@Rapid detection

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.075

*陕西省卫生和计划生育委员会卫生科研项目(D11)