陕西省人民医院心内一科(西安710068)

赵　娜　张　勇▲　刘小军　夏东雨　徐姣姣　刘仲伟　潘　 硕　于海奕△



·论著·基础研究·

PPARγ上调大鼠心肌细胞中miR-148b表达不依赖于转录水平*

陕西省人民医院心内一科(西安710068)

赵娜张勇▲刘小军夏东雨徐姣姣刘仲伟潘 硕于海奕△

目的：探讨PPARγ是否能上调大鼠心肌细胞中miR-148b表达，以及PPARγ上调miR-148b表达是否依赖于转录水平。方法：利用吡格列酮刺激大鼠H9C2心肌细胞PPARγ激动，应用GW9662特异性拮抗大鼠心肌细胞PPARγ激动。采用Real-time PCR法检测大鼠H9C2心肌细胞中miR-148b表达水平；利用生物信息学方法分析miR-148b启动子区域的PPARγ结合位点；应用染色质免疫共沉淀法(ChIP)验证PPARγ是否与miR-148b启动子结合。结果：吡格列酮剂量依赖性上调miR-148b表达(P<0.01)；吡格列酮上调miRs-148b表达后，给予PPARγ特异性拮抗剂GW9662，上调的miR-148b表达降至对照水平(P<0.01)；生物信息学预测miR-148b启动子区域存在PPARγ的两个结合位点；应用ChIP实验验证转录因子PPARγ不能与miR-148b启动子区域的两个预测结合位点结合。结论：PPARγ上调大鼠心肌细胞中miR-148b表达，但调控不依赖于转录水平。

主题词细胞/病理生理学心肌转录因子/代谢核糖核苷酸类/代谢动物，实验大鼠

MicroRNAs(miRNAs)在生物体内广泛存在，通过调控不同的RNA发挥生物学功能。miRNAs在生理发育及疾病进展中表达发生改变[1]，从miRNAs的生成生物学行为过程分析导致miRNAs表达改变的机制，有助于深入理解miRNAs所参与的病理变化过程。研究发现在哺乳动物细胞中内源性前列环素信号通路能上调miR-148b表达水平[2]。参与内源性前列环素信号通路的分子多种多样，其中PPARγ是其中的关键蛋白分子之一。本研究旨在探索:①PPARγ是否上调miR-148b表达水平；②如果PPARγ上调miR-148b表达水平，是否依赖于转录水平。

材料与方法

1大鼠心肌细胞H9C2培养大鼠H9C2细胞购自上海生物化学与细胞生物学研究所，参考文献方法培养[3]，待细胞融合至90%，更换含有1%胎牛血清的培养基，应用PPARγ激动剂吡格列酮(Pioglitazone)或PPARγ拮抗剂GW9662处理(Sigma-Aldrich, pioglitazone/1～10μmol)。

2实时荧光定量聚合酶链反应(Real time- QPCR)应用miRcute miRNA分离提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取分离小分子RNA(小于200个碱基)。MiRcute microRNA cDNA合成试剂盒及实时荧光定量PCR检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司)用于microRNA表达分析。实时荧光定量PCR采用ABI PRISM 7700检测系统完成。MiR-148b引物序列为: TCAGTGCATCACAGAACTTTGT；内参5S引物序列为: GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC。

3染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)参考Porro 等方法[4]，于大鼠H9C2细胞行ChIP实验。应用调整后的RIPA[1%十二烷基硫酸钠，5mmol乙二胺四乙酸，50mmolTris-盐酸(pH 8.1)，5%蛋白酶抑制剂cocktail]溶液裂解H9C2细胞，超声使裂解产物降解成为约200～1000bp大小的DNA碎片。然后用ChIP缓冲液[1% Triton X-100，2mmol 乙二胺四乙酸，150mmol 氯化钠，20mmolTris-盐酸(pH 8.1)，5%蛋白酶抑制剂Cocktail]稀释10倍，然后分别与PPARγ抗体，IgG抗体共孵育，于4℃过夜，加入蛋白A/G琼脂糖结合抗体-DNA复合物。随后交联物质进一步于65℃孵育6h解交联。免疫共沉淀得到的产物应用PCR分析。在miR-148b编码基因启动子上的用于扩增包含结合PPARr位点片段的两对引物分别为：5’-GCTCTAGAGTTACAATCATGTGCCAC-3’(上游引物)，5’-GCAAGCTTTCGAGACAAAGTTCTG-3’(下游引物)以及5’-GCAAGCTTTCTAGCAGCTGCCCAT-3’ (上游引物), 5’- GC CTCGAG TGGCTGTCTAGAAGACAGGATC -3’(下游引物)。用含有溴乙烷的2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

4生物信息学分析应用miRBase查询pre-miR-148b序列及编码基因，利用TRANSFAC和Promotor 2.0 Prediction Serve 软件预测分析Pre-miR-148b的转录因子。

结　果

1吡格列酮剂量依赖性上调大鼠H9C2细胞中miR-148b表达水平见图1。为明确PPARγ对miR-148b的调控作用,采用不同剂量的PPARγ激动剂吡格列酮(1～10μmol/L)刺激大鼠心肌H9C2细胞24 h后, 应用Real-time PCR方法检测H9C2细胞中miR-148b表达水平。结果显示与对照组相比，1 μmol/L吡格列酮对miR-148b表达无影响，5μmol/L吡格列酮显著上调miR-148b表达约4倍(P<0.01)，10μmol/L吡格列酮显著上调miR-148b表达约7倍。

2PPARγ上调大鼠H9C2细胞中miR-148b表达见图2。为进一步证实吡格列酮是否特异性通过PPARγ上调H9C2中miR-148b表达，利用PPARγ特异性拮抗剂GW9662刺激大鼠心肌H9C2细胞后，与吡格列酮共孵育。采用吡格列酮刺激大鼠H9C2细胞，miR-148b表达量显著上调(P<0.01)，在此基础上加用PPARγ拮抗剂GW9662后，上调的miR-148b表达下降至对照水平(P<0.01)，提示PPARγ上调大鼠H9C2细胞中miR-148b表达水平。

图1　吡格列酮剂量依赖性

图2　PPARγ上调大鼠H9C2细胞中miR-148b表达

3生物信息学预测miR-148b启动子与PPARγ结合位点见图3。采用生物信息学方法预测miR-148b编码基因启动子上是否存在PPARγ结合位点。对miR-148b所在基因启动子上游2000bp及下游500bp碱基进行分析，发现存在两个PPARγ结合位点。

4PPARγ与miR-148b启动子预测结合位点不发生结合见图4。利用染色质免疫共沉淀实验方法检测PPARγ是否与miR-148b启动子上的两个预测结合位点结合。结果显示：在大鼠心肌H9C2细胞中，PPARγ与miR-148b启动子两个预测位点结合均不能发生结合。

图3　生物信息学预测miR-148b启动子与PPARγ结合位点

图4　PPARγ与miR-148b启动子预测结合位点不发生结合

经典microRNA生成过程包括编码microRNA的基因在RNA聚合酶II或RNA聚合酶III作用下转录出pri-miRNA；Drosha/DGCR8复合体剪切pri-miRNA生成pre-miRNA；pre-miRNA在exportin 5作用下从细胞核输出到细胞浆中；Dicer酶剪切pre-miRNA生成成熟microRNA。除此途径以外，研究显示一些microRNA的生成不依赖于RNA聚合酶III(RNase III/Drosha或Dicer)的剪切过程[5]。本研究还发现：应用PPARγ激动剂能上调miR-148b表达量，由于吡格列酮不仅能激动PPARγ，还能激动其他信号分子，因此，我们在给予吡格列酮后，应用PPARγ特异性拮抗剂，发现上调的miR-148b水平下降至对照水平。证实PPARγ的确能上调miR-148b表达。

PPARγ是一种核转录因子，能通过转录途径调节体内多种多样代谢途径[6]。为进一步研究PPARγ是否通过转录水平上调miR-148b表达。我们进一步预测发现miR-148b的编码基因启动子存在PPARγ结合位点。但通过进一步的染色质免疫共沉淀结果否定了PPARγ与miR-148b编码基因启动子的结合，这些结果提示：PPARγ并非从转录水平上调miR-148b表达水平。PPARγ上调miR-148b表达是通过何种方式实现，根据上述的miRNAs生成的调控机制研究推测：①PPARγ通过其他激活其他转录因子，其他转录因子于转录水平上调miR-148b表达；②PPARγ可能通过影响Drosha,Dicer或exportin5的表达及活化于转录后水平影响miR-148b表达；③近期，一种新的RNA结合蛋白被发现能参与转录与转录后耦联过程[7]，关于PPARγ是否影响RNA结合蛋白进而通过转录-转录后耦联过程影响miR-148b表达尚未明确，提示亦是一种可能的机制。对于PPARγ调控miR-148b表达从转录以外的何种方式实现仍有待于未来研究进一步深入探讨。

[1]Zhao N, Yu H, Yu H,etal. MiRNA-711-SP1-collagen-I pathway is involved in the anti-fibrotic effect of pioglitazone in myocardial infarction[J]. Sci China Life Sci ，2013，56:431-439.

[2]Mohite AJ, Chillar AJ, Wijaya C,etal. Endogenous prostacyclin signaling regulating microRNA expression in mammalian cells[J]. FASEB J, 2009, 23: LB373.

[3]Yan W, Xuan C, Xuan L,etal. BN52021 protects rat cardiomyocyte from doxorubicin induced cardiotoxicity[J]. Int J Clin Exp Pathol， 2015，8:1719-1724.

[4]Porro A, Haber M, Diolaiti D,etal. Direct and coordinate regulation of ATP-binding cassette transporter genes by Myc factors generates specific transcription signatures that significantly affect the chemoresistance phenotype of cancer cells[J]. J Biol Chem ，2010，285：19532-19543.

[5]Havens MA, Reich AA, Duelli DM,etal. Biogenesis of mammalian microRNAs by a non-canonical processing pathway[J]. Nucleic Acids Res ,2012,40:4626-4640.

[6]Ahmadian M, Suh JM, Hah N,etal. PPARgamma signaling and metabolism: the good, the bad and the future[J]. Nat Med， 2013，19：557-566.

[7]Han N, Li W, Zhang M. The function of the RNA-binding protein hnRNP in cancer metastasis[J]. J Cancer Res Ther， 2013，9 (Suppl): 129-134.

(收稿：2016-03-20)

PPARγ up-regulated miR-148b expression in H9C2cells of rats is not dependent on the transcriptional level

First Department of Cardiovascular Medicine, The People，s Hospital of Shaanxi Province

(Xi’an 710068) Zhao NaZhang YongLiu Xiaojun et al

Objective: To explore wheather PPARγ up-regulates the miR-148b expression in cardiomyocytesof rats, and whether this process is dependent on the transcriptional level. Methods: Piogliatazone and GW9662 were used by PPARγ agonist and antagonist to stimulate H9C2cells in rats. Using Real-time PCR evaluate the expression level of miR-148b in H9C2cells of rats. Applying bioinformatics analysis predicte the binding sites between PPARγ and promoter region of miR-148b. Using chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay verify wheather PPARγ binds to the predicted binding sites in the promoter of miR-148b. Results: Pioglitazone up-regulated miR-148b expression in a dose-dependent manner (P<0.01).In addition, the up-regulated miR-148b expression by pioglitazone was inhibited totally by GW9662 (P<0.01). Bioinformatic analysis found two binding sites between PPARγ and promoter region of miR-148b. ChIP assay verify that PPARγ did not bind to the two predicted binding sites in the promoter region of miR-148b. Conclusion: PPARγ up-regulates miR-148b expression in cardiomyocytes of rats, but does no dependent on the transcriptional level.

Cell/physiopathologyMyocardiumTranscription factor/metabolismRibonucleotide/metabolismAnimails, laboratotyRats

R337.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.001

*国家自然科学基金青年科学基金项目(81400181)

△北京大学第三医院