新疆医科大学第二附属医院药剂科(乌鲁木齐830063)

陈　妍　缪　娟　高　宏△



欧芹根对非酒精性脂肪肝大鼠的有效成分及机制研究*

新疆医科大学第二附属医院药剂科(乌鲁木齐830063)

陈妍缪娟高宏△

目的：探讨欧芹根治疗脂肪肝的有效成分及其作用机制。方法：高脂乳剂，高脂饲料诱导大鼠非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)模型，选出其有效成分，并用ELISA法测肿瘤坏死因子(TNF-α)和脂联素水平。结果：经成分预试，5种有效成分为黄酮类物质，且动物实验提示该药总黄酮能促进脂联素水平的表达。结论：欧芹根总黄酮是该药治疗脂肪肝的有效成分，其作用机制可能与该药能提高脂联素表达水平相关。

主题词脂肪肝/药物疗法总黄酮类/代谢模型，动物大鼠@欧芹根@脂联素

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)指病变主要在肝小叶，以肝细胞脂肪变性和脂肪沉积为病理特征，但无过量饮酒史的临床病症[1]。近几年来，随着人民生活水平的提高，其患病率逐年上升。其对机体的危害，除了增加肝病相关的发病率和死亡率，更重要的是引起代谢异常等相关疾病[2]。新疆维药欧芹根在维医临床应用已久，该药对治疗肝炎、脂肪肝、关节炎等疾病具有良好疗效。我们结合临床用药特性对该药进行了护肝和降脂作用的药理学实验，发现该药有较好的疗效[3～5]。肿瘤坏死因子(TNF-α)作为一个炎症标志物，是与NAFLD发病的密切相关的致病因子，而脂联素是体内保护性细胞因子。本研究从TNF-α和脂联素水平调节程度去与探讨其有效成分及可能作用机制。

材料与方法

1 动物与材料SD大鼠330只，由新疆医科大学动物中心提供，体重为180±20g，自由饮食，饲养条件为22±2℃。欧芹根购自新疆参茸中维药饮片公司，粉碎后备用。水飞蓟宾胶囊(批号：550704068)由天津天士力圣特制药有限公司生产；大鼠脂联素ELISA放射免疫检剂盒：美国ADL公司。大鼠TNF-α放射免疫检剂盒：美国ADL公司。CHO、TG、ALT、AST均在新医大二附院检验科检测。

2有效部位筛选采用我们前期提取方法[5]，用相应的试剂萃取后得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4个干膏备用。

3脂肪肝动物模型的建立与分组

3.1分组：将105只大鼠随机分为7组,分别为空白对照组、阳性对照组、模型组、石油醚组、氯仿组、乙酸乙酯组、正丁醇组。所有大鼠喂养1周开始实验。

3.2模型建立：除空白对照给与生理盐水外，其余各组采用高脂乳剂(50g花生油加热，加入15g胆固醇融化，搅匀后加入3.5ml的吐温80，制成油相，使用50ml水、10g全脂奶粉、1g食盐、20g蔗糖和3.5ml丙二醇加热后介入1g脱氧胆酸钠，制成水箱，随后将油相和水相进行充分混合成高脂乳剂)，根据大鼠体重每周两次喂食，平时以高脂饲料维持，连续喂食12周。12周后每组随机处死3只，测定血脂CHO、TG值，制作病理切片，观察模型是否成功。

3.3给药：模型成功后，除了空白对照组与模型组外，其余各组加灌胃各组相应的药物(阳性组按4.5mg/kg灌胃水飞蓟宾胶囊，石油醚组、氯仿组、乙酸乙酯组、正丁醇组均按3g/kg灌胃)，空白组与模型组依旧按1ml/100g灌胃生理盐水。再连续灌胃8周。

3.4指标检测及结果：处死大鼠，取肝右叶同一部位肝组织，制作病理切片。腹主动脉取血，分离血清，测定胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)，筛选出有效部位为乙酸乙酯和正丁醇。

4有效成分的筛选

4.1药品的分离：采用我们前期提取分离方法[6]，将乙酸乙酯和正丁醇两个部位进行梯度洗脱，合并相同流分，共得到8个流分。

4.2动物模型的建立与给药：大鼠165只分为11组，分别为空白对照组、阳性对照组、模型组、流分1～8组。除空白对照给与生理盐水外，其余各组采用高脂乳剂,灌胃方法及检测指标同3.2。模型成功后，除了空白对照组与模型组灌胃生理盐水外，其余各组加灌胃各组相应的药物(阳性组按4.5mg/kg灌胃水飞蓟宾胶囊，1～8组均按50mg/kg灌胃)，再连续灌胃8周。

4.3指标检测及结果：处死大鼠，取肝右叶同一部位肝组织，制作病理切片。腹主动脉取血，分离血清，测定胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)，筛选出有效成分为5个流分，确定为欧芹根总黄酮。

5有效成分机制研究

5.1欧芹根总黄酮的提取分离：用70%乙醇回流提取欧芹根粗粉，浓缩干燥后得干浸膏，70%醇溶解后，用D-101型大孔树脂纯化，干燥后得欧芹根总黄酮粉末备用。

5.2总黄酮机制研究：对60只大鼠进行分组实验，随机分为正常组、模型组、水飞蓟素组和欧芹根总黄酮高、低剂量组，除了正常组，其他组均按3.2项下造模。模型成功后，除了正常组与模型组灌胃生理盐水外，其余各组加灌胃各组相应的药物(水飞蓟素组按4.5mg/kg灌胃水飞蓟宾胶囊，欧芹根总黄酮组高、低剂量按80mg/kg、40mg/kg灌胃)，再连续灌胃8周后处死大鼠，腹主动脉取血，分离血清，全自动生化仪测量ALT、AST，CHO、TG，ELISA法测肿瘤坏死因子(TNF-α)和脂联素水平。

结　果

1有效部位筛选结果见表1。四个部位中正丁醇和乙酸乙酯部位效果比较明显，且差异有统计学意义(P<0.05)。病理切片也显示正丁醇和乙酸乙酯部位及阳性组在组织形态学上均有一定程度的改善，肝细胞肿胀程度减轻，细胞未见明显的组织坏死。

2有效成分筛选结果8个流分中有5个流分效果比较明显(P<0.05)。病理切片也显示这5个流分在组织形态学上均有一定程度的改善，提示其有效成分可能为此5种流分共同作用。对此5个流分进行化学成分预测，发现1%三氯化铝试剂及氨熏检查呈阳性，说明此5种流分为黄酮类化合物。据此，我们推测该药材护肝作用的有效成分为欧芹根总黄酮。

表1　欧芹根治疗脂肪肝有效部位筛选±s)

注：模型组与空白对照组比较，#P<0.05, ##P<0.01；给药组与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01

3欧芹根总黄酮作用机制研究我们对欧芹根总黄酮治疗脂肪肝机制进行研究探讨，发现该药能促进非酒精性脂肪肝大鼠脂联素水平的表达，但是对TNF-α的作用并不明显，可能是和在给药过程中继续喂养高脂饲料有关。

讨　论

TNF-α是由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞等细胞合成、分泌的一种非糖基化蛋白。主要通过激活其他细胞因子和调节细胞的分化、增殖、坏死或凋亡，对脂肪代谢起一定作用。目前很多研究表明，TNF-α和非酒精性脂肪肝的发病密切相关。脂联素是由白色分泌组织分泌的一种蛋白，具有调节胰岛素敏感性、葡萄糖内环境平衡、抗动脉粥样硬化、促进脂肪酸氧化等作用，是机体调节脂质代谢和血糖稳定的重要因子。目前研究显示脂联素能减少肝中脂肪堆积及炎症介质作用，与非酒精性脂肪肝的发病有关[6]。本研究从TNF-α和脂联素水平这两个角度去探索欧芹根有效成分的作用机制，发现欧芹根总黄酮能促进脂联素水平的提高，但是对TNF-α的表达作用不明显。

新疆维药欧芹根主要分布在新疆的和田、阿克苏一带，临床及民间主要用于治疗脂肪肝等肝脏疾病。但由于缺乏实验基础，限制了该药的应用和推广。本研究对该药进行脂肪肝药效学实验及有效成分的筛选，并对其有效成分可能作用的机制进行了探讨，结果表明该药中的黄酮类成分对脂肪肝有较好的治疗效果。

[1]王成建,朱丽群,张 玮.非酒精性脂肪性肝病糖代谢异常与血清脂联素关系研究[J].临床医学工程.2012,9(19):1509-1510.

[2]邬月琴,白 琳,薛晔霞,等.非酒精性脂肪肝病与糖脂代谢相关分析[J].中国健康文摘,2013,10(6) :216-217.

[3]陈 妍, 乌莉娅·沙依提,马亮英.新疆维药欧芹根总黄酮的乙醇提取工艺优选及其大孔树脂筛选[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(15):19-21.

[4]陈妍,刘军,林伊梅，等.芹菜根提取物对D-氨基半乳糖所致急性肝损伤的保护作用研究[J].中国药房,2011,22(35):3272-3274.

[5]陈 妍,赵先彬,马亮英，等.维药芹菜根不同部位对四氯化碳诱导大鼠急性肝损伤的保护作用[J].医学信息,2011,24(9):5658-5659.

[6]林长青，高彦彬，刘桂芳，等.糖脂平胶囊岛素抵抗大鼠脂联素表达的影响[J].陕西中医，2009，30(5)：617-619.

(收稿：2016-03-11)

R575.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.09.003

*乌鲁木齐市科学技术计划项目(Y141310046)

△乌鲁木齐市友谊医院