杜雨，张珍，赵文宝，周芸，贾志春，郭敏超

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州　730070；2.庆阳市食品检验检测中心，甘肃 庆阳　745000)



聚乙二醇/K2HPO4双水相法提取牦牛血中的IgG

杜雨1，张珍1，赵文宝2，周芸2，贾志春1，郭敏超1

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州730070；2.庆阳市食品检验检测中心，甘肃 庆阳745000)

【目的】 探讨牦牛血中IgG的最佳提取工艺.【方法】 以牦牛血液为原料，在单因素试验的基础上，选取聚乙二醇浓度、K2HPO4浓度、NaCl浓度和pH为自变量，IgG的含量为响应值，根据响应面Box-Behnken试验设计原理，采用四因子三水平的分析法模拟得到二次多项式回归方程的预测模型.优化聚乙二醇/K2HPO4双水相法提取牦牛血中IgG的工艺条件.【结果】 聚乙二醇/K2HPO4双水相法提取牦牛血中IgG的最佳工艺条件为聚乙二醇 13%(w/w)、K2HPO417%(w/w)、NaCl 11%(w/w)、pH 6.0，在此条件下IgG质量浓度达13.82 mg/mL，与预测值14.04 mg/mL的相对误差为1.59%.【结论】 回归模型具有高度显著性，方程对试验拟合较好，可以对IgG的含量进行很好的分析和预测；各因子对IgG含量影响大小依次是PEG浓度>NaCl浓度>K2HPO4浓度>pH；

双水相法;聚乙二醇/K2HPO4;牦牛血;IgG

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)是一类具有抗体活性并能与相应的抗原发生特异性结合的球蛋白[1-2]，其中IgG在人和动物血液中含量最多[3-4].由于其特殊的免疫功能，所以IgG被应用于功能性食品、新型饲料、临床等方面[5-6].我国是牦牛的主要生产国，约占世界牦牛总数的94%，但对牦牛血液的利用，除有报道的从牦牛血液中提取凝血酶、SOD和少量食用外，大量血液被丢弃，造成了极大的资源浪费，并且对环境造成了污染.因此，从牦牛血中提取IgG，既可以充分利用牦牛血资源，又可以减少因污血排放而造成的环境污染，具有重大社会意义.

目前，国内从动物液中提取IgG的方法主要有饱和硫酸铵法、有机溶剂法和双水相法等，双水相法一般用于提取细胞培养上清液或含白蛋白的混合蛋白等中的IgG以及其他蛋白质中[7-9]，但未用于动物血液中IgG的提取.Sulk等[10]首次使用聚合物/磷酸盐体系提取纯化抗体，使用双水相萃取分离杂交瘤细胞的上清液中的IgG，最佳条件是5%PEG以及22%磷酸盐，IgG收率达到90%.Platis等[11]使用双水相法结合Protein A亲和层析的方法，分离转基因烟草的提取物中的单克隆抗体.在12%的PEG以及13%的磷酸盐条件下，单克隆抗体被分配到下相，其收率大约是95%.Andrews等[12]使用萃取和反萃取两步法来纯化杂交瘤细胞的上清液中的IgG，萃取的最佳条件为15%的PEG、14%的磷酸盐以及12%的NaCl，在两步萃取之后，IgG的纯度可达到80%.

尽管对动物血液中IgG的提取工艺条件已有一些文献报道，但对双水相法提取血液中的IgG的工艺条件尚未有所研究.因此，本研究以聚乙二醇/K2HPO4双水相法提取IgG，探索牦牛血中IgG的最优工艺，以期为牦牛血资源的充分利用，提高牦牛综合利用价值提供理论依据.

1　材料与方法

1.1试验材料

试验原料：新鲜牦牛血取自甘肃夏河，加抗凝剂抗凝后，吸取血清，冷藏备用.

牛IgG对照品，Beijing Blodee Blotechnology Company；羊抗牛IgG抗体(1:16-32)，Beijing Blodee Blotechnology Company；牛血清白蛋白，上海中秦化学试剂有限公司.

透析袋，美国进口；柠檬酸钠、氯化钡、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠、碘化钾、碘化汞、碳酸氢钠、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、聚乙二醇6 000(PEG)、叠氮钠.

1.2试验仪器

试验所用主要仪器为：高速冷冻离心机(H-1850R)、紫外分光光度计(UV722S)、分析天枰(FA2004)、数显恒温水浴锅(HH-S24)、数字酸度计(PHS-3C)、XH-B型旋涡混匀器.

1.3试验方法

1.3.1IgG含量测定采用紫外分光光度法对IgG的含量进行测定[13-14].

1.3.2聚乙二醇/K2HPO4双水相法提取IgG的操作步骤在经抗凝后的牦牛血清中，加入1 mol/L的BaCl2，沉淀，离心，去除凝血酶，收集上清液.然后将一定量PEG的母液、K2HPO4的母液、NaCl固体、血清和蒸馏水按比例混合均匀，调pH后，离心，静置以达到相平衡(进行萃取)，然后将上相取出；再将一定浓度的K2HPO4溶液加到前面取出的上相中，以形成PEG/K2HPO4双水相体系(进行反萃取)，最后取出其下相，进行后续的透析脱盐.

1.3.3单因素试验设计

1.3.3.1PEG浓度对IgG含量的影响取一定量血清，在14%的K2HPO4，12%的NaCl，pH 7.0和静置12 h的条件下(此条件是参照Andrews等人使用PEG/磷酸盐双水相萃取杂交瘤细胞的上清液中的IgG的最佳条件来确定)，PEG浓度设定为5%、10%、15%、20%、25%(w/w)，试验重复3次，测定IgG含量，确定最佳PEG浓度.

1.3.3.2K2HPO4浓度对IgG含量的影响取一定量血清，在最适PEG浓度，12%NaCl，pH 7.0和静置12 h的条件下，K2HPO4浓度设定为6%、10%、14%、18%、22%(w/w)，试验重复3次，测定IgG含量，确定最佳K2HPO4浓度.

1.3.3.3NaCl浓度对IgG含量的影响取一定量血清，在最适PEG、K2HPO4浓度，pH 7.0和静置12 h的条件下，NaCl浓度设定为8%、10%、12%、14%、16%(w/w)，试验重复3次，测定IgG含量，确定最佳NaCl浓度.

1.3.3.4pH对IgG含量的影响取一定量血清，在最适PEG、K2HPO4、NaCl的浓度和静置12 h的条件下，pH设定为5、6、7、8、9，试验重复3次，测定IgG含量，确定最佳pH.

1.3.3.5静置时间对IgG含量的影响取一定量血清，在最适PEG、K2HPO4、NaCl的浓度和pH的条件下，静置时间设定为3、6、9、12、15 h，试验重复3次，测定IgG含量，确定最佳静置时间.

1.3.4响应面设计在单因素试验基础上，选取其中4个对IgG含量影响较大的因素，运用Box-Behnken模型设计四因素三水平二次回归方程，拟合自变量与IgG含量之间的函数关系.

2　结果与分析

2.1IgG含量的标准曲线

由图1可见，线性回归方程为y=0.490 3x+0.358 8，R2=0.995 5，表明线性关系较好.将测定的吸光值代入上述回归方程中，计算出IgG的含量.

图1　IgG含量的标准曲线Fig.1　The standard curve of IgG

2.2PEG/K2HPO4双水相法提取牦牛血中IgG单因素试验结果与分析

2.2.1PEG浓度对IgG含量的影响由图2可知，IgG含量随PEG浓度的增加呈先增大后减小的趋势，在PEG浓度为15%时，IgG质量浓度达到最大值9.77 mg/mL，并与其他水平有显著性差异(P<0.05).PEG浓度10%和20%时的IgG质量浓度较15%分别下降了35.80%和19.60%，因此，选择15%为最优PEG浓度.

2.2.2K2HPO4浓度对IgG含量的影响由图3可知，IgG含量随K2HPO4浓度的增加呈先增大后减小的趋势，在K2HPO4浓度为18%时，IgG质量浓度达到最大值11.57 mg/mL，并与其他水平有显著性差异(P<0.05).K2HPO4浓度14%和22%时的IgG含量较18%分别下降了20.32%和33.97%，因此，选择18%为最优K2HPO4浓度.

图2　PEG浓度对IgG含量的影响Fig.2　Effect of the concentration of PEG on the IgG content

图3　K2HPO4浓度对IgG含量的影响Fig.3　Effect of the concentration of K2HPO4on the IgG content

2.2.3NaCl浓度对IgG含量的影响由图4可知，IgG含量随NaCl浓度的增加呈先增大后减小的趋势，在NaCl浓度为12%时，IgG质量浓度达到最大值11.16 mg/mL，并与其他水平有显著性差异(P<0.05).NaCl浓度10%和14%时的IgG含量较12%分别下降了32.91%和8.27%，因此，选择12%为最优NaCl浓度.

2.2.4pH对IgG含量的影响由图5可知，IgG含量随pH的增加呈先增大后减小的趋势，在pH为6时，IgG质量浓度达到最大值13.64 mg/mL，并与其他水平有显著性差异(P<0.05).pH 5和pH 7时的IgG含量较6分别下降了14.63%和19.47%，因此，选择6为最优pH.

图4　NaCl浓度对IgG含量的影响Fig.4　Effect of the concentration of NaCl on the IgG content

图5　pH对IgG含量的影响Fig.5　Effect of pH on the IgG content

2.2.5静置时间对IgG含量的影响由图6可知，IgG含量随静置时间的增加呈先增大后基本不变的趋势，静置时间3 h和6 h时的IgG含量较9 h分别下降了17.20%和12.12%，因此，选择9 h为最优静置时间.由于在静置时间为9 h的IgG含量(13.22 mg/mL)和12 h和15 h无显著性差异，所以在后面的响应面试验中不选取静置时间.

图6　静置时间对IgG含量的影响Fig.6　Effect of the silent period on the IgG content

2.3响应面试验结果及模型的建立

在单因素试验的基础上，利用响应面法确定牦牛血IgG最佳提取工艺，试验结果见表1.利用Design Expert软件对表1试验数据进行回归分析，得二次多元回归模型：

表2　响应面试验设计及结果Tab.2　The result and condition of response surface experiment

从图7可知四因素之间的交互作用的大小依次为NaCl浓度与PEG浓度的交互作用>pH与PEG浓度的交互作用>pH与NaCl浓度的交互作用>K2HPO4浓度与PEG浓度的交互作用>pH与K2HPO4浓度的交互作用>NaCl浓度与K2HPO4浓度的交互作用.

表3　回归模型方差分析Tab.3　Variance analysis of regression model

P<0.01表示该指标极显著(**)；0.01

图7　四因素之间交互作用对IgG含量的影响Fig.7　Effect of four-factors interaction on the IgG content

x1x3、x1x4、x3x4

2.4验证试验

本研究优化得出PEG/K2HPO4双水相法提取牦牛血中IgG的最佳工艺条件为：在12.86%PEG、17.01%K2HPO4、11.02%NaCl、pH 6.10时，IgG质量浓度的理论值为14.035 9 mg/mL，考虑到实际操作的可行性，将PEG/K2HPO4双水相法提取牦牛血中IgG的工艺优化为：13%PEG、17%K2HPO4、11%NaCl、pH 6.0.按上述条件进行验证试验，测定IgG质量浓度为13.82 mg/mL，IgG含量与预测值之间的相对误差为1.59%.证明应用响应面法优化的PEG/K2HPO4双水相法提取牦牛血中IgG工艺模型可行.

3　讨论

本研究确定PEG浓度为13%，K2HPO4浓度为17%，这2个数据同Platis等研究的结果基本一致.当PEG浓度一定时，IgG含量随着K2HPO4浓度的增加呈先升高后降低趋势，这是因为当K2HPO4浓度的增加时，K2HPO4固定的水分子也就增多，使富K2HPO4下相的亲水性增强，从而疏水性更强的IgG倾向于分配至疏水的富PEG上相，而其他杂蛋白(如白蛋白)则分配在亲水性较强的富K2HPO4下相中.但当K2HPO4浓度超过17%后，IgG含量降低，这是因为IgG也具有亲水性，当下相亲水性特别强时，IgG也会分配到下相，以致其无法和其他蛋白分离.甚至盐浓度增大时，上相会出现浑浊或沉淀的现象，这就说明此时的盐析作用比较强，会使盐离子和蛋白质同时争夺水分子，以致蛋白质失去水化层从而凝集析出.

NaCl浓度11%(w/w)，该数据与Andrews等研究结果基本一致，IgG含量随NaCl浓度的增大呈先增大后减小的趋势，这是因为添加NaCl后，使了两方面有所改变：双水相系统的两相间的疏水性差异增大，上相更加疏水，而下相更加亲水，这有利于促进不同蛋白质在两相间的差异分配；推动蛋白质的分子表面的疏水残基暴露.由于IgG分子的疏水残基较杂蛋白的要多，更倾向于分配到呈现更强疏水性的上相中.同时大部分杂蛋白(如白蛋白)依然分配在下相中.从而实现IgG与杂蛋白(如白蛋白)的分离.此外，添加NaCl会造成两相间电势的变化，这也是影响IgG在两相间分配的一个原因[15].

pH 6.0，该数据与Andrews等研究结果基本一致，pH值是影响蛋白质在双水相系统中分配的另一个重要因素.由于不同的蛋白质的带电残基数目不同，造成pH对其影响程度有所不同，而且在双水相系统中，盐离子的不平均分配可以促成两相之间的电势差.总体而言，pH对IgG的含量在PEG/K2HPO4系统中的影响没有前面3个因素大.主要原因是，在添加NaCl的情况下，IgG与上相之间的疏水相互作用强于静电相互作用，大部分IgG分配在上相中[16].

在单因素试验中，IgG含量随静置时间呈先增大后不变的趋势，在静置时间为9 h的IgG含量(13.22 mg/mL)与12 h和15 h无显著性差异，所以静置太长时间对IgG含量的影响不是很大，而且静置时间只是为了达到两相平衡，对IgG分配在上相还是下相中基本没有影响，因此在后面的响应面试验中没有选取静置时间.

4　结论

通过Box-Behnken试验设计，优化PEG/K2HPO4双水相法提取牦牛血中IgG的最优工艺参数为：13%(w/w)PEG、17%(w/w)K2HPO4、11%(w/w)NaCl、pH 6.0.在此条件下IgG质量浓度为13.82 mg/mL.与预测值14.035 9 mg/mL的相对误差为1.59%.

各因素影响IgG提取效果的大小顺序为PEG浓度>NaCl浓度>K2HPO4浓度>pH.通过对回归模型进行方差分析和交互作用分析，得知该回归模型极显著，对试验拟合较好.因此，采用响应面法分析优化得到的参数具有一定的实用价值.

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(责任编辑李辛)

Extraction of IgG from yak blood with PEG/K2HPO4aqueous two-phase system

DU Yu1,ZHANG Zhen1,ZHAO Wen-bao2,ZHOU Yun2,JIA Zhi-chun1,GUO Min-chao1

(1.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.The Food Inspection Centre of Qingyang,Qingyang 745000,China)

【Objective】 To optimize the extraction process for IgG from yak blood.【Method】 Yak blood was used as raw material,the extraction condition was optimized on the basis of single-factor test and the response surface methodology,IgG was extracted from yak blood with PEG/K2HPO4aqueous two-phase system.【Result】 The optimum extraction parameters were as PEG 13% (w/w),K2HPO417% (w/w),NaCl 11% (w/w),pH 6.0.The IgG content reached to 13.82 mg/mL under the conditions above mentioned,and the relative error was 1.59% with the theoretical value at 14.04 mg/mL.【Conclusion】 The model has a significant difference,and the established regression equation for the concentration of IgG has an excellent goodness of fit.The concentration of IgG could be analyzed and predicted by the model.Factors influencing the extraction are in the order as: PEG concentration>NaCl concentration>K2HPO4concentration>pH.

aqueous two-phase system;PEG/K2HPO4;yak blood;IgG

杜雨(1991-)，女，硕士研究生，研究方向为食品科学.E-mail:tsdy1225@163.com

张珍，女，副教授，博士，硕士生导师，主要从事食品科学与工程专业的教学和科研工作.E-mail：zhangzhen@gsau.edu.cn

甘肃省自然基金(1107RGZA23)：血免疫球蛋白G制备及功能特性研究；甘肃省农牧厅生物技术专项(GNSW-2013-22)：牛血液免疫球蛋白酶法制备关键技术研究.

2015-03-27；

2015-05-06

TS 251.93

A

1003-4315(2016)04-0154-07