孙京海，潘晴，李凌军，马鲁豫

(1.济南市妇幼保健院，山东 济南 250001；2.山东省皮肤病性病防治研究所,山东 济南 250022；3.山东中医药大学，山东 济南 250355；4.山东省医学科学院，山东 济南 250001)

女贞子中齐墩果酸含量测定及促进葡萄糖消耗体外细胞实验研究△

孙京海1，潘晴2，李凌军3，马鲁豫4*

(1.济南市妇幼保健院，山东 济南250001；2.山东省皮肤病性病防治研究所,山东 济南250022；3.山东中医药大学，山东 济南250355；4.山东省医学科学院，山东 济南250001)

目的：测定10批不同批次女贞子中齐墩果酸含量，并对女贞子醇提物的降血糖作用进行体外细胞实验研究。方法：用10倍量70%乙醇水溶液提取1h，提取多次，直至最后一次提取液中检测不到齐墩果酸含量，合并多次提取液，浓缩，通过HPLC法测定10批次不同产地女贞子中齐墩果酸的含量；用人肝癌细胞HepG2细胞来研究女贞子醇提物的降糖作用。结果：不同批次女贞子中齐墩果酸的含量有一定差异，含量不得低于0.50%；不同浓度的女贞子醇提液均有促进细胞消耗葡萄糖的作用，且在一定范围内随浓度升高而增强。结论：女贞子药材的醇提物具有促进葡萄糖消耗的作用，值得进一步研究推广。

女贞子；齐墩果酸；葡萄糖消耗

女贞子为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实，其味甘、苦，性凉，归肝、肾经。其用药历史悠久，被《神农本草经》列为上品，有滋补肝肾、明目乌发的功能。现代药理研究表明女贞子具有保肝、增强免疫、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎抑菌、降血糖、血脂等药理作用[1-4]。

近年来，随着人们生活水平的不断提高，高血糖的发病率呈明显上升趋势，且逐渐有年轻化趋势[5]。当血糖值高过规定的水平时就会形成高血糖症。女贞子具有降血糖的功效，据报道，其药效成分主要为齐墩果酸[6]。本研究用HPLC测定了10批女贞子中齐墩果酸的含量，用体外细胞实验的方法研究女贞子提取物的降糖作用。

1 仪器与材料

1.1仪器

D2000日立高效液相色谱仪，KQ-250E型超声波清洗仪(江苏省昆山市超声仪器有限公司)，AE240型电子分析天平(上海市安亭电子仪器厂)，细胞培养板、CO2培养箱(无锡久平仪器有限公司)，超净工作台，倒置显微镜，酶标仪。

1.2材料

10批女贞子(济南漱玉平民大药房)，经山东中医药大学李宝国副教授鉴定为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实。

齐墩果酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：20130416)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，乙醇(95%分析纯)，磷酸(分析纯)，娃哈哈纯净水，HepG2细胞株(中国科学院细胞生物学研究所)，DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基(上海创赛科学仪器有限公司)，胎牛血清FBS、PBS洗液、胰酶(TrypsinEDTA)、葡萄糖测定试剂盒(南京建成科技有限公司)。

2 方法与结果

2.1含水量与杂质含量测定

按《中华人民共和国药典》2010版方法测定10批女贞子药材的含水量与杂质含量。结果如表1所示。其中山东济宁产女贞子的含水量最高为8.7%，

表1 10批不同产地女贞子杂质含量与含水量

高于《中华人民共和国药典》规定的8%，为排除含水量对齐墩果酸含量测定的影响，提取前均将药材烘干至恒重。杂质含量符合《中华人民共和国药典》规定的不超过3%。

2.2含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱为DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)；以甲醇-乙腈-水-磷酸(50∶40∶10∶0.03)为流动相；紫外检测器检测；检测波长为210nm；柱温：30℃；流速：1.0mL·min-1。齐墩果酸对照品及女贞子样品色谱图见图1。

注：A.齐墩果酸对照品；B.女贞子样品。图1 齐墩果酸对照品及女贞子样品色谱图

2.2.2绘制标准曲线 精密称定干燥至恒重的齐墩果酸对照品16.33mg，加入乙醇(分析纯)定容至10mL容量瓶中，分别进样1、5、10、15、20、30μL，按照2.2.1中色谱条件测定，以峰面积A(Y)对齐墩果酸质量m(X)进行线性回归，得到回归方程Y=5×108X+2.9×105，r=0.9996(n=6)，线性范围为1.633～48.99μg。

2.2.3供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的女贞子药材粉末(过40目筛)5g，用70%乙醇水溶液浸泡30min后，10倍量70%乙醇水溶液提取1h，提取多次，直至提取液中检测不出齐墩果酸，合并提取液浓缩，蒸干，用乙醇(95%分析纯)定容至100mL容量瓶。

2.2.4精密度试验 分别精密吸取线性范围内高、中、低3种不同浓度的对照品溶液20μL，按上述色谱条件重复进样5次，测得峰面积的RSD值，分别为0.07%、0.40%、0.43%，说明仪器精密度良好。

2.2.5重复性试验 取同一批次供试品6份，按相同的方法制备供试品溶液，分别吸取20μL进样，测定齐墩果酸的含量，计算RSD=4.027%，说明该方法重复性良好。

2.2.6回收率试验 取线性范围内已知含量的供试品6份，每份分别精密加入高、中、低3种剂量的对照品，按供试液制备方法制备，测定女贞子中齐墩果酸的含量，计算平均回收率以及RSD值。结果如表2所示。

表2 女贞子中齐墩果酸回收率试验

2.2.7 样品的测定 取上述10批女贞子药材，按2.2.3项下制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液10 μL，进样测定样品中齐墩果酸含量，每批药材平行试验2次，结果取均值，见表3。

表3 10批女贞子中齐墩果酸含量(n=2)

3 齐墩果酸促进葡萄糖消耗作用研究

肝脏是人体内物质的代谢中心，在糖代谢的过程中也起着至关重要的作用，它既是利用葡萄糖又是产生葡萄糖的主要器官。人肝癌细胞HepG2细胞虽然是一种癌细胞，但它起源于肝脏并且基本具有正常肝细胞的生物特性，所含的生物转化代谢酶与人正常肝细胞具有同源性，分化程度较高，并且保留了较完整且活性稳定的生物转化代谢酶[7-8]。故本研究用人肝癌细胞HepG2细胞来研究齐墩果酸的促进葡萄糖消耗作用。

3.1细胞培养

将经复苏的HepG2细胞用含10%FBS的DMEM培养基，于5%CO2、37℃环境下进行培养，48h更换一次培养液。待细胞贴壁生长达80%后开始传代培养，每隔2d传代1次，用于实验。

3.2细胞实验及结果

当细胞生长至一定浓度后，将DMEM低糖培养基换成DMEM高糖培养基。培养24h以后，取生长状况较好的细胞，用PBS洗液清洗，经胰酶消化悬浮后接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μL，先用移液枪将吹打均匀的细胞吸起来，然后枪头紧贴孔的一侧壁(枪头勿接触孔底)，缓缓地把细胞注入，每孔复6孔，MTT法测定细胞数量。待细胞充分贴壁后，弃去原来的培养基，每孔加入200μL高糖的DMEM培养基。实验设置7组，5个加药组，药物质量浓度分别为100、200、300、400、500μg·mL-1，1个空白对照组，1个含1μg·mL-1二甲双胍的阳性药对照组。培养24h后，用葡萄糖试剂盒测定培养液中葡萄糖含量。空白孔的含糖量减去接种细胞孔的含糖量，即各孔细胞的葡萄糖消耗量(GC)。各组细胞的葡萄糖摄取率情况如图2所示。

图2 各组细胞葡萄糖摄取率

由结果可知，不同质量浓度的女贞子提取液均有促进细胞消耗葡萄糖的作用，300μg·mL-1组的降糖效果接近二甲双胍组，加药组开始随着加药量的增加，降糖效果增强，增加到一定程度后，降糖效果增加的不显著，反倒开始减弱。

HepG2细胞葡萄糖消耗试验结束后，加入20μL5g·L-1的MTT，继续培养4h，弃去培养液，加入DMSO与细胞混匀，震荡5～10min，用酶标仪于570nm处测光密度度值，用光密度值来反映细胞的生长状况。结果显示，空白对照组细胞生长速度最快；女贞子粗提物加药组，起初随着浓度增加细胞增长速度加快，直至浓度300μg·mL-1，此后随着加药浓度增加，细胞增殖速度减缓，但是不明显，由此可知女贞子粗提物并没有明显的细胞毒性；二甲双胍组的细胞生长情况与400μg·mL-1女贞子粗提物加药组相似。

4 讨论

女贞子的醇提物具有一定的降糖功效，其主要药效成分为齐墩果酸，本研究探讨了10批不同产地女贞子的齐墩果酸的含量情况，可将齐墩果酸含量作为女贞子药材新的质量标准的补充，并通过人肝癌细胞HepG2细胞的体外细胞实验来验证女贞子醇提物的降糖功效。体外细胞实验是体外药理学一种理想的研究方法，具有周期短、易操作、便于检测等优点。本研究采用的人肝癌细胞HepG2细胞，具有正常肝细胞的生物学特性，广泛地用于药理实验研究，也是研究降血糖作用的常用菌株。当前，随着人们生活水平提高，高血糖患者逐年增加，开发降糖、不良反应小的新药变得尤为重要。

[1] 刘亭亭，王萌.女贞子化学成分与药理作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(14)：228-234.

[2] 张金玲，王小虎，邓振涛，等.中药女贞子的化学成分及药理作用研究进展[J].现代中西医结合杂志，2013，22(36)：4100-4101.

[3] 杨曦，蒋桂华.女贞子的研究开发现状与展望[J].时珍国医国药，2008，19(12)：2987-2990.

[4] 黄新苹，王武朝.中药女贞子的化学成分研究进展[J].国际药学研究杂志，2011，38(1)：47-51.

[5] 何玲，王佐伟.3239人体检高血压、高血糖、高血脂情况调查分析[J].当代医学，2013，19(2)：8-10.

[6] 谢灵璞.齐墩果酸对高血糖大鼠胰岛素及肝糖原含量的影响[J].中华中医药学刊，2012，30(7)：1669-1670，1711.

[7] 张红芝.翻白草降糖作用及对肝细胞糖代谢影响的研究[D].北京：中国农业大学，2005.

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DeterminationofContentOleanolicAcidinLigustriLucidiFructusbyHPLCandItsEffectonPromotingtheGlucoseConsumptioninvitro

SUNJinghai1，PANQing2，LILingjun3，MALuyu4*

(1.JinanMaternalandChildCareHospital，Jinan250001，China;2.ShandongProvincialInstituteofDermtovenereology,Jinan250022，China；3.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250355，China；4.Shandongacademyofmedicalsciences，Jinan250001，China)

Objective：To measure the content of oleanolic acid in10different batches of Ligustri lucidi Fructus and study the hypoglycemic effect of the ethanol extract of Ligustri lucidi Fructusinvitro.Methods：Ligustri lucidi Fructus were extracted by10folds of70% ethanol,1h a time, and extracted several times until oleanolic acid was undetectable, the extracts were then merged and enriched. The content of oleanolic acid was determined by HPLC. The hypoglycemic effect of the ethanol extract of Ligustri lucidi Fructus was studied by human liver cancer cell HepG2cells.Results：The content of oleanolic acid of the different batches of Ligustri lucidi Fructus varied and was above0.50%. Different concentrations of extract showed the effect of promoting cells to use glucose, and the effect increased with the concentration within a certain scope.Conclusion：The ethanol extract of Ligustri lucidi Fructus has the effect of promoting the glucose consumption, it deserves for further study .

Ligustri lucidi Fructus; Oleanolic acid; glucose consumption

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.013

2015-04-19)

“十二五”重大新药创制国家科技重大专项(2013ZX09103002-005)

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马鲁豫，副研究员，研究方向：中药新药开发；E-mail：maluyuyky@126.com