张颖，郭盛，朱邵晴，严辉，王强，徐璐，段金廒

(南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

不同生长期酸枣叶中多类型资源性化学成分的积累变化与分析评价△

张颖，郭盛*，朱邵晴，严辉，王强，徐璐，段金廒*

(南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京210023)

目的：研究不同生长期酸枣叶中多类型资源性化学成分的动态变化规律，为酸枣叶适宜采收期的确定及资源高效利用提供依据。方法：采用UPLC-TQ/MS法和HPLC法分别建立酸枣叶中19种核苷类和23种氨基酸类，以及黄酮类成分芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的分析方法，并比较不同生长期酸枣叶中上述组分的组成及含量变化趋势。结果：不同生长期酸枣叶中多类型资源性化学成分含量差异较大。其中，核苷类化学成分随生长期变化总体含量表现为先升高后降低，再升高后再降低的双峰变化趋势；氨基酸类化学成分总量总体表现为先升高后降低的变化趋势；黄酮类化学成分总体表现为含量由高渐低的变化趋势。3类化学成分均以6月28日所采集样品含量相对较高。结论：综合分析，酸枣叶以制茶为主要利用目的其适宜采收期应为6月下旬。本研究结果为酸枣叶适宜采收期的确定提供了科学依据，也为酸枣叶资源的有效利用提供了数据支撑。

酸枣叶；核苷类；氨基酸类；黄酮类；采收期

鼠李科枣属植物酸枣Ziziphusjujubavar.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chow为重要的药用植物资源，广泛分布于我国北方广大低山丘陵地区。其干燥成熟种子为临床常用养心安神中药酸枣仁，具养心补肝、宁心安神、敛汗、生津之功效。但除其种子外，在其生长过程中产生的大量枝叶、果肉等资源缺乏有效利用途径而多被废弃。本草记载，酸枣叶、花、果肉、棘刺、树皮及根均可药用。其中，酸枣叶又名棘叶，《本草纲目》记载其具有“敛疮解毒，治胫臁疮”之功，可用于臁疮的治疗[1]。近年来，有利用酸枣叶开发为具有调节神经衰弱之心神不安、失眠多梦，改善心肌缺血，降血压，降血脂等保健作用的功能性茶饮的研究报道[2]；也有文献记载，酸枣叶及同属其他植物叶片在伊朗等中东地区还常作为制备甜味抑制剂的主要原料[2-3]。但以上利用途径均尚未形成产业规模。本课题组前期在进行枣属药用植物资源化学研究过程中，为促进枣叶及酸枣叶资源的有效利用，对其化学成分组成进行了系统研究，发现酸枣叶中富含黄酮类、三萜酸及其皂苷类、酚酸类、核苷类、氨基酸类等多种类型活性成分[4-8]，并围绕不同干燥加工方法对其活性成分的影响进行了研究[9]，为酸枣叶干燥加工工艺的建立提供了依据。本文在前期研究的基础上，以酸枣叶中含有的与其营养保健功效密切相关的核苷类、氨基酸类、黄酮类化学成分为指标，考察其不同生长期化学成分的变化趋势，以期为酸枣叶适宜采收期的确定及资源高效利用提供依据。

1 仪器与材料

1.1仪器

LabconcoFreeZone2.5L冷冻干燥机(美国Labconco公司)，Waters2695HPLC及WatersACQUITYUPLC系统(包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器；Waters公司，Milford，USA)，XevoTQ检测器(Waters公司)，MassLynxTM质谱工作站软件(Waters公司)，BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，EPED超纯水系统(南京易普易达科技发展有限公司)，KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)，Microfuge22R型离心机(德国Beckman公司)。

1.2材料

氨基酸类化学对照品(亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸、γ-氨基丁酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸、牛磺酸、酪氨酸、丙氨酸、4-羟基脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸)、核苷类化学对照品(胸腺嘧啶、胸苷、2′-脱氧腺苷、腺嘌呤、尿苷、腺苷、2′-脱氧肌苷、肌苷、胞嘧啶、胞苷、鸟苷、2′-脱氧腺苷-5′-单磷酸、腺苷-5′-单磷酸、鸟苷-5′-单磷酸、胞苷-5′-单磷酸、2′-脱氧尿苷、肌苷-5′-单磷酸、环磷酸鸟苷、环磷酸腺苷、次黄嘌呤)均购自Sigma公司；黄酮类化学对照品芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷均购自中国食品药品检定研究院；以上化学对照品纯度经HPLC检测均大于98%。

乙腈为色谱纯(德国默克公司)；超纯水(18.2MΩ·cm)为经易普易达超纯水系统自制；其他化学试剂均为分析纯(上海国药化学试剂公司)。

酸枣叶样品于2015年6—10月采自南京中医药大学药用植物园，其基原植物经南京中医药大学段金廒教授鉴定为鼠李科植物酸枣Ziziphusjujubavar.spinosa(Bunge) Hu ex H.F.Chow。药材标本存放于南京中医药大学标本馆。样品采集后，去离子水清洗表面，-70℃密封贮存。样品采集信息见表1。

表1 酸枣叶样品信息

2 方法与结果

2.1样品预处理

取不同成熟期的新鲜酸枣叶样品，经冷冻干燥至含水量约为10%(见表1)，粉碎过2号筛。

2.2氨基酸及核苷类化学成分的分析

2.2.1色谱及质谱条件 色谱柱：AcquityUPLCBEHAmide(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相：A-含5mmol·L-1甲酸铵、乙酸铵和0.2%甲酸的水溶液，B-含1mmol·L-1甲酸铵、乙酸铵和0.2%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱(0～3min，10%A；3～9min，10%→18%A；9～15min，18%→20%A；15～16min，20%→46%A；16～20min，46%A)。流速：0.4mL·min-1，柱温：35℃，进样量：1μL。质谱检测条件同文献[9]。色谱图见图1。

图1 核苷及氨基酸类化学成分UPLC-TQ/MS图

2.2.2对照品溶液的制备 取干燥至恒重的各核苷与氨基酸对照品适量，精密称定，以少量10%甲醇溶解，置10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，配成混合核苷与氨基酸对照品溶液。

2.2.3供试品溶液的制备 取样品粉末1.0g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入超纯水50mL，称重，静置30min后，超声(100Hz，50℃)60min，冷却后加超纯水补足减失重量，摇匀，13000r·min-1离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得。

2.2.4线性关系考察 精密量取对照品母液适量，加水配制成系列浓度的混合对照品溶液，按2.2.1项下色谱及质谱条件进样分析，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，以进样量为横坐标(X)进行线性回归，计算其相关系数(r)。结果显示，所测定的19种核苷类、23种氨基酸类化学成分在其相应的线性范围内r为0.9954～0.9997，表明该方法线性关系均良好。

2.2.5精密度试验 取混合对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件连续进样6次测定，结果显示所测定成分峰面积的RSD在1.51%～4.49%，表明本方法的精密度良好。

2.2.6重复性试验 取同一样品(编号：S2)6份，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，进样测定，所测定成分质量分数的RSD在2.33%～4.85%，表明本方法的重复性良好。

2.2.7稳定性试验 取供试品(编号：S2)溶液12h内每隔2h进样测定，结果显示所测定成分峰面积的RSD在2.15%～4.33%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.2.8加样回收率试验 取已测定的样品(编号：S2)6份，精密称定，分别加入各对照品适量，制备供试品溶液，进样测定，结果显示所测定成分的平均回收率在95.28%～103.71%，RSD<4.5%，表明该方法准确可靠。

2.2.9样品测定 取样品适量，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，按外标一点法计算质量分数，分析结果见表2。

2.3黄酮类化学成分的分析

2.3.1色谱条件 GRACE Apollo C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：28℃，流动相A：乙腈，流动相B：水(含0.1%甲酸)；梯度洗脱程序：0～5min，10%～15% A；5～15min，15% A；15～15.2min，15%～18% A；15.2～40min，18% A；40～41min，18%～22% A；41～55min，22% A；55～58min，22%～95% A；58～60min，95% A；流速：0.8mL·min-1，进样体积：10μL，检测波长：360nm。色谱图见图2。

注：A.对照品溶液；B.样品溶液；1.芦丁；2.金丝桃苷；3.异槲皮苷。图2 酸枣叶中黄酮类化学成分HPLC图

2.3.2对照品溶液的制备 取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成质量浓度为0.187、0.039、0.068mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3.3供试品溶液的制备 取样品粉末1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水溶液20mL，称重，静置30min后，超声(100Hz，50℃)30min，冷却后加70%甲醇水溶液补足减失重量，摇匀，13000r·min-1离心10min，取上清液过0.45μm滤膜，取续滤液，即得。

2.3.4线性关系考察 精密量取对照品母液适量，加甲醇配制成系列浓度的混合对照品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样分析，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，以进样量(μg)为横坐标(X)进行线性回归，计算r。结果显示，芦丁线性回归方程为Y=1.91×106X+1.66×103，线性范围：0.0374～3.74μg(r=0.9996)；金丝桃苷线性回归方程为Y=4.44×106X+2.08×104，线性范围：0.0156～1.56μg(r=0.9999)；异槲皮素苷线性回归方程为Y=5.06×106X-2.25×104，线性范围：0.0272～2.72μg(r=0.9999)。以上结果表明该方法线性关系均良好。

2.3.5精密度试验 取混合对照品溶液，按2.3.1项下色谱条件连续进样6次测定，结果显示芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为0.85%、0.56%、1.02%，表明本方法的精密度良好。

2.3.6重复性试验 取同一样品(编号：S2)6份，精密称定，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果显示芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷质量分数的RSD分别为1.52%、1.89%、1.97%，表明本方法的重复性良好。

2.3.7稳定性试验 取供试品溶液12h内每隔2h进样测定，结果显示芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷峰面积的RSD分别为1.10%、0.98%、1.21%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.3.8加样回收率试验 取已测定的样品6份，精密称定，分别加入各对照品适量，制备供试品溶液，进样测定，结果显示芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷的平均回收率分别为98.19%、97.02%、102.33%，其RSD分别为1.87%、2.04%、2.21%，表明该方法准确可靠。

2.3.9样品测定 取样品适量，精密称定，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样测定，按外标一点法计算质量分数，分析结果见表2。

表2 不同生长期酸枣中核苷类、氨基酸类及黄酮类成分分析结果(n=3)

注：a表示未检测到；b表示低于定量限。

3 分析与讨论

3.1核苷类化学成分的动态变化规律分析

有研究证实，核苷类化学成分具有广泛的生理活性，是生物细胞维持生命活动的基本组成元素，参与DNA代谢过程，具有抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、改善脑细胞代谢、镇静中枢神经、抗血小板凝集、抗心律失常和抗惊厥等多种生物活性，还有学者认为核苷类化学成分可能是补益中药的共同物质基础。如表2所示，酸枣叶中富含核苷类资源性化学成分，表明其具有较高的营养及保健价值。所测定的19种核苷类化学成分中，以磷酸化的核苷类化学成分如鸟苷-5′-单磷酸、腺苷-5′-单磷酸、胞苷-5′-单磷酸，以及尿苷、鸟苷含量相对较高。核苷类成分总量总体呈现出先升高后降低，再升高再降低的双峰变化趋势，以6月28日采集样品(S2)和9月18日采集样品(S6)核苷类成分总量相对较高，分别为0.83、0.82mg·g-1。不同种类核苷类成分呈现出不同的变化趋势，其中含量相对较高的尿苷、胞苷-5′-单磷酸呈现出与总核苷较为一致的双峰变化趋势，而鸟苷、2′-脱氧腺苷-5′-单磷酸、鸟苷-5′-单磷酸则整体呈现出先升高后降低的变化趋势。

3.2氨基酸类化学成分的动态变化规律分析

由表2可知，不同生长期酸枣叶样品中均富含氨基酸类化学成分，其氨基酸总量可达1.81mg·g-1以上。8种必需氨基酸中，除甲硫氨酸含量相对较低、难以检测外，其余均存在于多数样品中，表明酸枣叶具有较高的营养保健价值。不同生长期酸枣叶中总氨基酸含量总体表现为先升高后降低的变化趋势，以6月28日所采集样品(S2)含量最高，达3.05mg·g-1。不同种类氨基酸呈现出不同的变化趋势。其中，含量相对较高的氨基酸如谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、γ-氨基丁酸，其含量变化呈现出与总氨基酸较为一致的先升高后降低趋势，且以6月28日所采集样品(S2)含量相对较高。据报道，谷氨酸具有肝脏保护作用，且具有兴奋中枢神经系统作用；天冬氨酸能调节脑和神经的代谢功能，具有改善疲劳作用；γ-氨基丁酸是一种天然存在的非蛋白组成氨基酸，可参与多种代谢活动，具有健脑益智、促进睡眠、延缓脑衰老机能、降血压等作用；酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料，应用于美白化妆品中，可有效地抑制黑素的生成，此外尚具有抗抑郁作用。据此，如以氨基酸为主要利用目的，以6月下旬采摘较为适宜。

3.3黄酮类化学成分的动态变化规律分析

酸枣叶中富含黄酮类化学成分，其中以芦丁含量相对较高。所测定3种黄酮类成分总量随酸枣叶的生长整体呈现出由高渐低的变化趋势，6月8日采集样品(S1)和6月28日采集样品(S2)3种黄酮类成分总量相对较高，分别为8.15、8.26mg·g-1，至近落叶时(10月9日)采集样品(S7)其含量降至4.74mg·g-1，降低了近43%。3种黄酮类成分中，芦丁整体表现出与总黄酮含量较为一致的变化趋势，而异槲皮苷表现为在酸枣叶生长后期(8～9月)积累量增大，至近落叶时(10月9日)其含量又急剧下降的变化趋势。研究显示，芦丁具有抗氧化、抗衰老、保护心脑血管等多重生物活性。本研究结果显示酸枣叶为富含黄酮类化学成分芦丁的植物资源，表明其具有重要的营养保健价值，且提示如以芦丁为主要利用目的，以6月采集较为适宜。

3.4酸枣叶适宜采收期的确定

已有报道显示，以枣叶制茶时，以5月和6月所采摘的枣叶所制得的茶色泽嫰绿、汤色明亮、滋味鲜醇浑厚，整体品质优于其他时间所采摘的枣叶[10]。本研究显示，生长期为6月下旬的酸枣叶其核苷类、氨基酸类及黄酮类化学成分的含量均相对较高。因此，综合考虑所制茶的品质、活性成分组成与含量，以6月下旬采摘较为适宜。

此外，在产地为促进酸枣树花芽分化及增加坐果率和增大果重，摘心抹芽是矮化密植枣园管理的重要环节。目前酸枣树摘心抹芽多在5～7月进行，因此可利用6月下旬摘心抹芽过程中所产生的酸枣叶资源开发酸枣叶茶等功能性产品，促进酸枣叶资源的有效利用。

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DynamicAnalysisofNucleosides，AminoAcidsandFlavonoidsinLeavesofZiziphusjujubavar.spinosaCollectedinDifferentGrowthPeriod

ZHANGYing，GUOSheng*，ZHUShaoqing，YANHui，WANGQiang，XULu，DUANJinao*

(JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，andNationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To investigate the dynamic changes of multiple ingredients inZiziphusjujubavar.spinosaleaf (ZSL) collected in different growth period，and provide the data for selection of the suitable harvest time of ZSL.Methods：UPLC-TQ MS and HPLC methods were used to determine the contents of19nucleosides and23amino acids as well as rutin，hyperoside and isoquercitrin in ZSL and their contents in the samples collected in different growth periods were compared.Results：The content differences of nucleosides，amino acids and flavonoids in ZSL collected in different growing periods were greatly obvious.Among them，the content of nucleosides generally exhibited two peaks with the leaf growth.Amino acids content showed a trend that increased firstly，then decreased.For flavonoids，a gradually reducing trend from the high level of their whole content was found.The total content of these three types constituents were relatively high in samples collected in June28th.Conclusion：Given the above results，the suitable harvesting time for ZSL should be in late June when it was mainly used to prepare the tea.The results of this study provide a scientific basis for selecting the suitable harvesting period for ZSL as well the data for the efficient utilization of ZSL resource.

Ziziphusjujubavar.spinosaleaf；nucleosides；amino acids；flavonoids；harvesting time

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.7.011

2015-12-31)

国家自然科学基金面上项目(81473538)；教育部霍英东教育基金会高等院校青年教师基金项目(141040)；国家中医药行业科研专项(201407002)；江苏省中药资源产业化过程协同创新中心重点项目(ZDXM-2-8)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(ysxk-2014)

*

郭盛，博士，研究方向：中药资源化学及资源循环利用，E-mail：guosheng@njucm.edu.cn；段金廒，教授，研究方向：中药资源化学及资源循环利用，E-mail：dja@njucm.edu.cn