郑心，彭召云,，孟宪志，庄贺

1.山东中医药大学第二附属医院，山东济南 250001；2.山东中医药大学，山东济南 250014

肺抑瘤膏对EGFR野生型Lewis肺癌小鼠肿瘤生长及LC3表达的影响

郑心1，彭召云1,2，孟宪志1，庄贺2

1.山东中医药大学第二附属医院，山东济南 250001；2.山东中医药大学，山东济南 250014

目的 建立Lewis肺腺癌小鼠移植瘤模型，取移植瘤进行EGFR基因测序，观察肺抑瘤膏对移植瘤的干预作用。方法 使用C57BL/6小鼠，接种Lewis肺腺癌细胞，造模成功后，随机分4组，生理盐水对照组（组Ⅰ）、肺抑瘤膏组（组Ⅱ），3-MA组（组Ⅲ），Rap组（组Ⅳ），药物干预后，观察瘤重，并进行电镜、Western Blot检测及EGFR基因测序。结果 EGFR基因测序示：非突变型。肺抑瘤膏可以明显减轻移植瘤瘤重，组Ⅱ与生理盐水对照组瘤重比较，差异有统计学意义（P＜0.05），组Ⅱ抑瘤率为25.22%；以自噬抑制剂3-MA、自噬诱导剂Rap作为对照分析，肺抑瘤膏组与3-MA组在瘤重、LC3/β-actin相对表达量两方面比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而与Rap组在瘤重、LC3/β-actin相对表达量两方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。电镜提示肺抑瘤膏可影响肿瘤细胞自噬。结论 肺抑瘤膏能够明显抑制EGFR非基因突变型肺腺癌移植瘤的生长，且可能通过影响肿瘤细胞自噬起到治疗作用。

肺抑瘤膏；Lewis肺癌；EGFR非基因突变型；LC3

原发性支气管肺癌现居全球癌症首位[1]，其中，肺腺癌占肺癌发病率的25%左右[2]，其确诊时绝大多数已属中晚期，化疗耐药、放疗抵抗等问题的存在[3-4]，应用单一治疗方法均难以获得满意疗效，EGFR非基因突变型肺腺癌靶向治疗效果差[5]，目前临床治疗迫切需要安全、有效的综合治疗方案，中药抗EGFR非基因突变型肺腺癌的研究有重要临床意义。该实验通过观察肺抑瘤膏干预EGFR非基因突变型小鼠肺腺癌移植瘤模型，应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）、自噬诱导剂雷帕霉素(Rap)作为对照，探讨在细胞自噬方面抑制EGFR非基因突变型肺腺癌发生发展的作用机制。

1 临床资料

1.1 实验动物及条件

C57BL/6近交系雄性小鼠 [（合格证号 SCXK(鲁) 20140007）]，6～8周龄，体重（18±2）g，购于山东省实验中心。接种了Lewis鼠源肺腺癌细胞株的小鼠，购于国家实验细胞资源共享平台。于SPF级动物房常规饲养至适应环境后，进行造模。

1.2 主要实验试剂及药物

Taq DNA聚合酶、DNA分子量Marker，测序试剂：ABI BigDye3.1。BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、预染Marker、SDS-PAGE电泳液、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、PVDF膜、内参、内参二抗等。微管相关蛋白1轻链LC3抗体（CST）。戊二醛固定液。0.9%氯化钠注射液，雷帕霉素（Rap，稀释为0.85 mg/mL）（北京华迈科），3-甲基腺嘌呤（3-MA，稀释为1.5 mg/mL），肺抑瘤膏（膏方含生药量约4.3 g）由山东中医药大学第二附属医院药剂科提供[（灌胃0.2 mL/（次·d），相当于70 kg成人按体表面积折算的等效剂量）]。

2 实验方法

2.1 造模方法

颈椎脱臼法处死1只肿瘤生长良好的Lewis肺腺癌荷瘤小鼠，在超净工作台上用无菌镊子、剪刀完整剥离肿瘤组织，于冰上制备细胞悬浊液，低温离心、计数后调整细胞浓度为1.0 mL×107 mL，两人合作在小鼠腋窝下接种肿瘤细胞悬液0.2 mL/只（约含瘤细胞2.0×106个）[6]。

2.2 分组及给药

接种肿瘤细胞后，每日观察小鼠腋下移植瘤情况，当能摸到米粒大小瘤体时，说明瘤细胞接种成功。按照SPSS统计软件随机设立生理盐水对照组（组Ⅰ）、肺抑瘤膏干预组（组Ⅱ），3-MA组（组Ⅲ），Rap组（组Ⅳ），10只/组。分组后开始药物干预。组Ⅰ予生理盐水灌胃0.2 mL/（次·d）。组Ⅱ予肺抑瘤膏灌胃0.2 mL/（次·d）。组Ⅲ予提前稀释分装的3-MA，0.2 mL/次，腹腔注射，2次/周。组Ⅳ予提前稀释分装的Rap，0.2 mL/次，腹腔注射，2次/周。

2.3 观察指标及方法

①瘤重、抑瘤率：末次灌胃24 h后称重处死小鼠，快速剥离瘤体，称瘤重，计算各组肿瘤抑制率。肿瘤抑制率=（生理盐水对照组平均瘤重-用药组平均瘤重）/生理盐水对照组平均瘤重×100%

②电镜检测：剥离瘤体后，把标本块修整成符合要求的颗粒（≤0.5 mm），以最快的速度（最多 2 min），浸入戊二醛固定液，送检。

③LC检测：免疫印迹法检测移植瘤中自噬特异蛋白LC蛋白表达。

④EGFR检测：组Ⅰ、组Ⅱ小鼠移植瘤进行EGFR基因（18、19、20、21号外显子）毛细管电泳测序。

2.4 统计方法

采用 SPSS 17.0统计学软件分析所有数据，采用均数±标准差(±s)形式表示计量资料，行t检验；[n（%）]表示计数资料，行χ2检验，其中 P＜0.05，说明差异有统计学意义，P＞0.05，说明差异无统计学意义。

3 实验结果

3.1 一般情况

随移植瘤的生长，各组小鼠的活动逐渐减少，精神萎靡，毛发无光泽易脱落，攻击性明显降低，进食、饮水减少，组Ⅲ小鼠表现最明显。

3.2 种植成功率

接种Lewis细胞后一周内所有小鼠腋下均可触及移植瘤，瘤体积均可达一定大小(约100～150 mm3)，成瘤率100%，造模成功率100%。

3.3 瘤重、抑瘤率

组Ⅱ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ抑瘤率分别为25.22%、1.37%、32.55%、瘤变具体见表1。

表1 小鼠移植瘤的瘤重[(±s)，g]

表1 小鼠移植瘤的瘤重[(±s)，g]

注：各组间瘤重比较：与组Ⅰ比较，▲P＜0.05；与组Ⅱ比较，☆P＜0.05。与组Ⅲ比较，△P＜0.05；与组Ⅳ比较，□P＜0.05。

组别 瘤重组Ⅰ（n=10）组Ⅱ（n=10）组Ⅲ（n=10）组Ⅳ（n=10）（8.05±0.36）☆□（6.02±0.40）▲△（7.94±0.28）☆□（5.43±0.5）5▲△

3.4 透射电镜

透射电镜提示：肺抑瘤膏可影响肿瘤细胞自噬，见图1。

图1 各组透射电镜图片（8000×）

3.5 Western blot结果

LC3、β-actin表达量，见图2，图3。

图2 LC3、β-actin蛋白条带

图3 LC3/β-actin相对表达量柱状图

图3各组间LC3/β-actin相对表达量比较：生理盐水对照组与3-MA组比较P=0.888，与肺抑瘤膏组比较P= 0.014，与Rap组比较P=0.004。肺抑瘤膏组与3-MA组比较P=0.019，与Rap组比较P=0.544。3-MA组与Rap组比较P=0.005。

3.6 EGFR基因毛细管电泳测序结果

（1）基因组DNA与PCR扩增产物，见图4、图5。

作业成本法的采用不只是管理层和财务部门实施的结果，作业成本法需要企业全员参加和支持。这是一个复杂的系统国产，其数据来源于企业基层，来源于每个员工的工作，作业成本法的推进和改革，需要企业各个部门的配合。

图4 样品基因组DNA电泳图

图5 PCR扩增产物电泳图

（2）项目总结：20个样品的18，19，20，21号外显子均测序合格。①其中20号外显子含poly A和poly G结果，已经进行加测反应；②比对结果显示无明显突变。

4 讨论

导师以中医辩证论治为指导，结多年临床经验拟定了肺抑瘤膏方，首次把中医膏方引入肺癌的临床与实验研究。方中以党参、黄芪为君补益肺脾之气；白术祛湿助脾气健运、茯苓渗湿健脾、麦冬养阴生津润肺清心、女贞子滋补肝肾共为臣药。佐以浙贝、夏枯草、山慈菇清热散结，薏苡仁渗湿健脾，贯众清热凉血，莪术破血行气、消积止痛，蜂房攻毒破积。生甘草清热解毒，调和诸药为使。本方诸药合用，组方严谨，扶正而不敛邪，祛邪而不伤正，气血同治，寒热平调，平补阴阳，无耗气伤阴之弊。整体体现了扶正祛邪、动静结合、攻补兼施的配伍特点。前期临床研究发现晚期肺癌患者应用肺抑瘤膏，可有效控制原发肿瘤病灶，减轻化疗引起的不良反应，提高患者的生存质量，延长患者生存期。且膏剂有口感好、剂型小、服用量少、便于携带、易于耐受等优点，充分体现了中药简、便、廉、验的特点。前期动物实验从抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、提高机体免疫功能等多环节入手进行了一系列研究，但对肿瘤细胞自噬的研究尚属首次。

自噬是溶酶体对细胞内的部分细胞质、细胞器等进行一系列降解过程的统称。许多研究发现自噬可以在抗肿瘤方面发挥重要作用，如通过诱发肿瘤细胞发生程序性死亡，从而抑制细胞生长[7-9]。对自噬的分析一般是对组织切片标本进行电镜观察和 LC3蛋白的检测[10]。自噬检测的金标准是自噬性结构的电镜下形态学观察，透射电子显微镜是观察自噬现象的最直接、最经典的方法。最常用的检测自噬标志物LC3蛋白表达的方法是蛋白印迹法。

该次实验通过EGFR基因测序，证实Lewis肺腺癌EGFR基因为非基因突变型。通过肺抑瘤膏组与生理盐水对照组比较，发现肺抑瘤膏组在减轻小鼠腋下移植瘤瘤重、提高肿瘤抑制率方面均明显优于生理盐水对照组，提示肺抑瘤膏对EGFR非基因突变型肺腺癌移植瘤原发病灶有明显的抑制作用，能有效抑制其瘤体生长，降低移植瘤的生长率。以自噬抑制剂3-MA、自噬诱导剂Rap作为对照分析：电镜结果示应用自噬抑制剂3-MA后，自噬小泡数量较生理盐水对照组明显减少，应用自噬诱导剂Rap后，自噬小泡数量较生理盐水对照组明显增加，与文献描述一致。应用肺抑瘤膏干预后，自噬小泡数量亦较生理盐水对照组明显增加，说明肺抑瘤膏可影响肿瘤细胞自噬。蛋白的Western blot结果示3-MA可明显抑制自噬标志物LC3蛋白表达，Rap可诱导自噬蛋白LC3的表达，两者比较差异有统计学意义（P=0.005），与文献中描述一致。肺抑瘤膏组与3-MA组在瘤重、LC3/β-actin相对表达量两方面比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），与Rap组在瘤重、LC3/β-actin相对表达量两方面比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。说明肺抑瘤膏能明显抑制EGFR非基因突变型肺腺癌移植瘤生长，增加自噬标志蛋白LC3表达，结合电镜结果，推测肺抑瘤膏可能是通过诱导肿瘤细胞自噬而发挥治疗作用的，为进一步研究其作用机制提供了证据及思路。

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Expression of LC3 throug Anti-lung Tumor Ointment in Lewis Lung Model Mice of EGFR Non Genetic Mutations

ZHENG Xin1，PENG Zhao-yun1，2，MENG Xian-zhi1，ZHUANG He2
1.Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong Proivnce,250001;2.Shandong U-niversity of Traditional Chinese Medicine,Jinan,Shandong Proivnce 250014 China

Objective Through the establishment of Lewis lung tumor model in mice,the transplanted tumors were detected EGFR gene sequencing and Anti-lung Tumor Ointment were observed the intervention effect for transplanted tumors.Methods The C57BL/6 mice were inoculated with Lewis lung carcinoma cells to established of Lewis lung tumor model.The mice were randomly divided into four groups after successful modeling.Normal saline group (group I),Anti-lung Tumor Ointment group(group II),3-MA group(group III),Rap group(group IV).We observed the tumor weight and the electron microscope,and Western Blot,and EGFR gene sequencing.Results EGFR gene sequencing shows:Non-mutant.Anti-lung Tumor Ointment can significantly reduce the tumor weight.GroupⅡcompared with groupⅠin tumor weight,expression were different(P＜0.05).Group II tumor suppressor rate was 25.22%.GroupⅡcompared with group III in tumor weight and LC3/β-actin relative expression,expression were different(P＜0.05).GroupⅡcompared with group IV in tumor weight and LC3/β-actin relative expression,expression were no different(P＞0.05).Electron microscopy result show that Anti-lung Tumor Ointment can affect autophagy.Conclusion Anti-lung Tumor Ointment can significantly inhibit transplanted tumor growth of EGFR non genetic mutations of lung adenocarcinoma in lewis lung model mice,and may play a therapeutic rolethrough the induction of autophagy.

Anti-lung Tumor Ointment;Lewis lung carcinoma;EGFR non genetic mutations;LC3

R73；R28

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.03.07

2016-07-20；

2016-08-18

郑心（1964.1-），女，山东济南人，博士，主任医师，主要从事肺癌及肺间质病的中西医结合诊断与治疗研究工作。