王丹丹　宋宁宁　亢春彦　陈建中

1)郑州大学第二附属医院乳腺外科　郑州　450014　2)河南医学高等专科学校病理教研室　新郑　451191



常山酮联合拉帕替尼对乳腺癌脑转移的抑制作用研究

王丹丹1)宋宁宁1)亢春彦2)陈建中1)

1)郑州大学第二附属医院乳腺外科郑州4500142)河南医学高等专科学校病理教研室新郑451191

目的探讨常山酮联合拉帕替尼对乳腺癌脑转移的抑制作用。方法以人乳腺癌细胞MDA-MB-231及BALB裸鼠分为溶剂组、拉帕替尼组、常山酮+拉帕替尼组。首先通过体外实验，以MTT法及划痕试验观察各组MDA-MB-231增殖及迁移能力；然后制备乳腺癌脑转移模型，通过神经功能评分及脑部HE染色观察各组脑转移情况。结果拉帕替尼显著抑制了MDA-MB-231的增殖及迁移能力，并减少了MDA-MB-231向脑部的定植作用。常山酮显著增强了拉帕替尼的治疗效果。 结论常山酮联合拉帕替尼能够显著提升拉帕替尼对乳腺癌脑转移的抑制作用。

乳腺癌；脑转移；常山酮；拉帕替尼

乳腺癌是我国女性最常见的恶性肿瘤之一[1]。随着近年治疗技术的进步，乳腺癌患者的生存期逐渐延长，脑转移的发生率有所增加。25%～30%的乳腺癌表达人表皮生长因子受体(humanepidermalgrowthfactor2，HER2)，该受体参与调控肿瘤细胞增殖和迁移，其过度表达不仅与乳腺癌的恶化程度呈正比，且与脑转移密切相关[2]。目前，大多抗癌药物不能通过血脑屏障(bloodbrainbarrier，BBB)，导致乳腺癌脑转移后生存期极低，1a生存率<20%[3]。因此寻找能够通过BBB的抗癌药物对乳腺癌脑转移的治疗有重要临床意义。

拉帕替尼为一种小分子HER1及HER2抑制剂，已有研究证实该药能够通过BBB到达颅内，对乳腺癌脑转移有较好的治疗效果，目前已成为乳腺癌脑转移的一线药物之一；常山酮为新型光谱抗球虫药，能够通过BBB，对结肠癌、白血病及乳腺癌等发挥抗癌作用[4]。本研究旨在探讨常山酮联合拉帕替尼对乳腺癌脑转移的治疗效果，以发现、提高治疗乳腺癌脑转移的药物与方法。

1　材料与方法

1.1实验材料及分组裸鼠(BALB/c-nu/nu，雌性，6周龄，体质量16～22g)购于南京大学模式动物研究所，人乳腺癌细胞MDA-MB-231购于美国ATCC公司，DMEM、胎牛血清均购于Hyclone公司，MTT试剂盒购于中国康为试剂公司，常山酮等化学试剂购于Sigma公司。本实验分为3组：溶剂组、拉帕替尼组、常山酮+拉帕替尼组。

1.2细胞活性测定将人乳腺癌细胞MDA-MB-231以1×104/孔的密度接种于24孔板，于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24h，然后分别加入DMEM、拉帕替尼(终浓度为0.5μM)及常山酮(终浓度为100nM)培养48h。之后将培养液吸出，加入MTT(最终浓度62.5μg/mL)，在37 ℃培养4h，之后吸出上层液体，加入DMSO后将上清取出，使用分光光度计在570nm波长下观察吸收值，以测定各组细胞增殖能力。每组重复8次。

1.3细胞迁移能力测定本实验使用划痕试验测定不同组别迁移能力。首先将MDA-MB-231细胞接种于24孔板，待细胞生长至90%左右，使用200μL枪头在各组培养孔底部自上而下画一条竖线，然后依据组别加入DMEM、拉帕替尼(终浓度为0.5μM)及常山酮(终浓度为100nM)。将培养板置于37 ℃条件下培养24h。使用倒置显微镜拍照，并通过ImageJ软件计算各组划痕两侧细胞之间的平均距离。每组重复8次。

1.4乳腺癌脑转移模型制作依据Kunal等[5]方法制作乳腺癌脑转移模型[5]：通过腹腔注射水合氯醛麻醉，常规消毒后打开胸腔，在左心室注射1.75×105MDA-MB-231人乳腺癌细胞，之后依次缝合伤口，于5周后通过改良的神经功能评分(mNSS)观察裸鼠神经功能体征及脑部切片HE染色的方式观察乳腺癌脑转移情况。其中溶剂组不做任何处理，拉帕替尼组在注射MDA-MB-231细胞同时以100mg/kg剂量腹腔隔天注射拉帕替尼5周，常山酮+拉帕替尼组则在注射MDA-MB-231细胞同时分别以50mg/kg及100mg/kg的剂量隔天腹腔注射拉帕替尼及常山酮5周。每组各12只。

2　结果

2.1不同组别细胞增殖情况拉帕替尼(0.5μM)显著抑制了MDA-MB-231细胞的增殖作用，常山酮(100nM)显著增强了拉帕替尼抑制MDA-MB-231细胞增殖作用的疗效。见表1。

表1　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼对MDA-MB-231细胞增殖作用的影响

注：与溶剂组相比，*P<0.05；与拉帕替尼组相比，#P<0.05

2.2不同组别迁移能力变化比较拉帕替尼(0.5μM)显著抑制了MDA-MB-231细胞的迁移能力，常山酮(100nM)显著增强了拉帕替尼抑制MDA-MB-231细胞增殖作用的疗效。见表2。

表2　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响±s)

注：与溶剂组相比，*P<0.05；与拉帕替尼组相比，#P<0.05

2.3不同组别乳腺癌转移情况mNSS神经功能评分及脑部HE染色显示，制备乳腺癌脑转移模型时同时处理拉帕替尼(100mg/kg)显著抑制了MDA-MB-231细胞定植于脑部的能力，常山酮(50mg/kg)显著增强了拉帕替尼抑制MDA-MB-231向脑部定植能力的疗效。见表3。

表3　拉帕替尼、常山酮+拉帕替尼对MDA-MB-231向脑部定植能力的影响

注：与溶剂组相比，*P<0.05；与拉帕替尼组相比，#P<0.05

3　讨论

乳腺癌脑转移作为乳腺癌患者终末期比较常见的转移癌类型，因多数常规抗肿瘤药物不能通过血脑屏障而导致治疗困难，目前临床上多采用全脑放疗加化疗的方式改善患者症状[6]。乳腺癌患者发现脑转移后存活率极低，因此积极寻找能够通过血脑屏障的高效抗癌药物对预防及治疗乳腺癌脑转移具有重大的现实意义。如前所述，25%～30%的乳腺癌表达HER2，该受体与乳腺癌恶化及转移密切相关；拉帕替尼为一种小分子HER1及HER2抑制剂，已有研究证实，其能够顺利通过血脑屏障到达颅内乳腺癌转移灶，并通过阻断HER2受体显著减小转移灶体积，提示拉帕替尼可能预防并治疗乳腺癌脑转移[7]。但近期研究提示，拉帕替尼可能会诱导乳腺癌的抗药性，进而导致治疗失败。因此如何提高拉帕替尼的治疗效果、短期高效的抑制脑转移灶的活性尤为重要。

常山酮为中药提取物，前期主要应用于家禽类的抗球虫治疗[7]。但近十几年来，国内外学者发现其能通过抑制MMPs蛋白、TGF系列通路等明显抑制结肠癌、血液系统肿瘤及乳腺癌的生长，并可以通过血脑屏障，提示其可能为脑部原发性肿瘤及转移性肿瘤的潜在药物[8-10]。本研究发现，拉帕替尼在体外能够显著抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖活性及迁移能力，且在制备乳腺癌脑转移模型时应用可以显著减少乳腺癌细胞向脑部的定植作用。常山酮不仅能够提高拉帕替尼抑制MDA-MB-231增殖及迁移的能力，而且与拉帕替尼合用可以大幅度提升拉帕替尼防治乳腺癌细胞向脑部定植的能力。本研究结果说明，拉帕替尼能够抑制乳腺癌细胞向脑部定植能力，但合用常山酮可以大幅度提升治疗效果，可能为治疗乳腺癌脑转移新的治疗手段。但常山酮通过何种机制促进拉帕替尼的治疗效果尚需进一步深入研究。

[1]杜铁桥，王永利，于盛会，等.北京市女性乳腺癌危险因素与乳腺癌相关性的探讨[J].中华肿瘤防治杂志，2010，17(1)：5-8.

[2]王建东，王全胜，白熠洲，等.mTOR信号通路在乳腺癌拉帕替尼耐药细胞系中的作用[J].中华医学杂志，2013，93(24)：1 915-1 917.

[3]王涛，江泽飞，宋三泰，等.拉帕替尼等治疗乳腺癌脑转移全脑放疗后再复发1例[J].中华医学杂志，2009，89(4)：286-287.

[4]JinML，ParkSY，KimYH，etal.Halofuginoneinducestheapoptosisofbreastcancercellsandinhibitsmigrationviadownregulationofmatrixmetalloproteinase-9[J].IntJOncol，2014，44(1)：309-318.

[5]TaskarKS，RudrarajuV，MittapalliRK，etal.LapatinibdistributioninHER2overexpressingexperimentalbrainmetastasesofbreastcancer[J].PharmRes，2012，29(3)：770-781.

[6]MarshallDA，DealK，BombardY，etal.Howdowomentrade-offbenefitsandrisksinchemotherapytreatmentdecisionsbasedongeneexpressionprofilingforearly-stagebreastcancer?Adiscretechoiceexperiment[J].BMJOpen，2016，6(6)：e010 981.

[7]PinesM，SpectorI.Halofuginone-themultifacetedmolecule[J].Molecules，2015，20(1)：573-94.

[8]PinesM.Halofuginoneforfibrosis，regenerationandcancerinthegastrointestinaltract[J].WorldJGastroenterol，2014，20(40)：14 778-14 786.

[9]YoungSL，Al-HendyA，CoplandJA.Potentialnonhormonaltherapeuticsformedicaltreatmentofleiomyomas[J].SeminReprodMed，2004，22(2)：121-30.

[10]StreeterEH，HarrisAL.Angiogenesisinbladdercancer--prognosticmarkerandtargetforfuturetherapy[J].SurgOncol，2002，11(1/2)：85-100.

(收稿2016-03-21)

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1673-5110(2016)16-0121-02