刘晶晶，陈晶瑜

培养条件对金黄色葡萄球菌-大肠杆菌混合生物被膜的影响

刘晶晶，陈晶瑜*

（中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京 100083）

以常见食源性致病菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为研究对象，采用微孔板法对混合生物被膜形成过程中的不同影响因素进行了研究。结果表明：在25℃或30℃条件下，采用质量分数0.8%的胰酶大豆肉汤（TSB）或0.8%的脑心浸出液（BHI）培养基培养时，生物被膜形成量较高；添加适量的葡萄糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖可提高混合生物被膜形成能力；培养基中NaCl质量分数＞8%时，混合生物被膜的生长明显受到抑制。

金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；双菌种生物被膜；培养条件

生物被膜（biofilm，BF）是指粘附于接触表面，分泌胞外多聚物，将其自身包围其中而形成的微生物群落［1］。在食品生产环境中，生物被膜一旦形成，常规消毒方法可能无法对其进行有效清除，而生物被膜中的细胞一旦脱离，就会发生食品交叉污染，因此给食品安全带来极大威胁［2］。

在自然条件下，大多数生物被膜是由多种微生物组成的混合生物被膜，这增加了不同菌种之间的相互作用和胞外分泌物的复杂性，从而改变生物被膜菌种的生理特性以及整个被膜的功能［3］。有研究表明，由单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantaru）形成的混合生物被膜，其对消毒剂的抵抗能力比浮游态和单一菌株生物被膜态强［3］。ADAMB等［4］报导，在白色念珠菌（Candida albicans）与表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）形成的混合菌种生物被膜中，表皮葡萄球菌分泌的胞外多聚物能有效抑制抗真菌药物氟康唑的渗透，并为不产粘液的白色念珠菌形成保护膜。由此可见，食品加工环境中非生物表面上食源性病原菌混合生物被膜的研究是至关重要的。

影响生物被膜形成的因素有很多，而营养供应和环境条件被认为是调控微生物粘附行为以及生物被膜形成的重要因素。如在HAMANAKA D等［5］的实验中，假单胞菌生物被膜明显受到培养温度和营养水平的影响。NGUYEN D等［6］在其研究中提出，可将生物被膜的生长温度和pH作为栅栏因子从而达到控制生物被膜形成的目的。此外，靳嘉巍等［7］研究了葡萄糖对生物被膜诱导的分子机制，研究结果表明葡萄糖可能是通过诱导表皮葡萄球菌ica基因的表达和多聚β-1，6-2-脱氧-2-氨基-D-吡喃葡萄糖（PIA）的合成，促进生物被膜的形成。邢盼盼［8］对食品加工设备中金黄色葡萄球菌生物被膜的研究表明，麦芽糖对生物被膜的形成有微弱的诱导作用。由此可见，探究一些常见的环境条件参数对混合生物被膜形成的影响，可为探索食品生产过程中生物被膜的控制方法提供一定理论依据。本研究考察了不同培养条件对两种常见食源性病原菌（大肠杆菌与金黄色葡萄球菌）混合生物被膜形成的影响，以期了解混合生物被膜的特性并为建立混合生物被膜的控制方法提供基础数据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心；大肠杆菌（Escherichia coli）：分离自北京市某农贸市场生肉区，本研究室分离、鉴定并保藏。

1.1.2试剂

蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、结晶紫、草酸铵、甲醇、冰醋酸（均为分析纯）：北京北化精细有限责任公司。

1.1.3培养基

胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soy broth，TSB）：胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L。脑心浸出液培养基（brain-heart infusion medium，BHI）：蛋白胨10 g/L，脱水小牛脑浸粉12.5 g/L，脱水牛心浸粉5 g/L，氯化钠5 g/L，葡萄糖2 g/L，磷酸氢二钠2.5 g/L。

1.2仪器与设备

Wellscan MK3酶标仪：美国热电有限公司；YW30Z高压湿热灭菌锅：北京科瑞科学仪器材有限公司；LHR-150（F）生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YT-CJ-2ND型洁净工作台：亚泰科隆仪器技术有限公司。

1.3方法

1.3.1种子液制备

将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活化后分别接种于TSB培养基中，37℃、120 r/min恒温振荡培养至OD600nm约为1.0左右，制成种子液备用［9］。

1.3.2双菌种混合生物被膜的培养

首先向96孔细胞培养板中每孔添加200 μL制备好的无菌培养基，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌液按照体积比1∶1混匀后以1%的接种量进行接种。最后，将接种的孔板分别置于25℃、30℃、37℃恒温培养箱中培养3 d，每一实验组及对照组设置3个平行，对照孔只加无菌培养基，每24 h更换一次新鲜培养基。

1.3.3结晶紫染色法对混合生物被膜形成能力的检测

培养结束后，弃去培养基，并用300 μL无菌磷酸盐缓冲液冲洗3次，洗去浮游菌体和杂质；然后于每孔中添加200μL无水甲醇固定15min，随后将悬浮液移去，并于60℃烘箱中干燥固定1 h；于每孔中添加2%的结晶紫200 μL染色20 min，用自来水冲洗干净，干燥；每孔添加体积分数为33%的冰醋酸300 μL，室温静置10 min；在波长630 nm处测定吸光度值［10］，吸光度值可反映生物被膜的形成能力，其值高于0.24均被认为可形成较厚的生物被膜［11］。

1.3.4培养基质量分数对混合生物被膜形成能力的影响

分别配制质量分数为0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、 6.4%的TSB和BHI培养基，每孔添加200 μL上述培养基，培养方式和混合生物被膜形成能力的检测如上所述，每一实验组及对照组设置三个平行，对照孔只加无菌培养基，每24 h更换一次新鲜培养基［12］。

1.3.5 NaCl质量分数对混合生物被膜形成能力的影响

分别配制含NaCl质量分数为0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%的（3%，w/w）TSB培养基，每孔分别添加200 μL上述培养基，培养方式和混合生物被膜形成能力的检测如上所述，平行试验3次［13］。

1.3.6单一碳源对混合生物被膜形成能力的影响

为研究食品加工厂中常见碳源对混合生物被膜形成能力的影响，首先配制含不同质量分数0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%葡萄糖的（3%，w/w）TSB培养基，每孔添加200μL培养，培养方式和混合生物被膜形成能力的检测如上所述，平行试验3次，再以蔗糖、麦芽糖和乳糖替换葡萄糖来配制不同糖含量的TSB培养基（糖含量和生物被膜培养方式同上）检测不同糖分对生物被膜形成能力的影响［14］。

1.3.7数据分析

采用Origin 8.5软件进行数据分析。

2　结果与分析

2.1不同培养温度下培养基质量分数对混合生物被膜形成能力的影响

在食品工厂中生长的细菌经常处于波动的营养环境中，而营养供应被认为是调控微生物黏附行为以及生物被膜形成的重要因素。HAMANAKA D等［5］对假单胞菌生物被膜的研究显示，单菌种生物被膜在20倍稀释的TSB培养基中比正常浓度的TSB培养基中生长状况好。因此，本研究分别测定了TSB质量分数和BHI含量对混合生物被膜形成能力的影响，结果（见图1）可知，在两种培养基条件下混合生物被膜的形成呈现出相同的趋势，即在较低培养温度（25℃或30℃）下，当培养基质量分数由0.2%增加至0.8%时，混合生物被膜活菌数呈上升趋势，随后，随着培养基质量分数的升高被膜形成量下降。这说明混合生物被膜在贫营养条件下生长较好，推测可能是由于贫营养条件给细菌造成了一个胁迫环境，导致细菌更加倾向于呈生物被膜态生长，最终处于相对安全的环境。所不同的是，在37℃条件下，随TSB含量增加，混合生物被膜生长呈现出先减少后增加的趋势；而在37℃下BHI环境中，混合生物被膜生长状况与培养基质量分数却没有显著的相关性。可能在不同温度下，微生物形成被膜的最适营养浓度不同，而且混合生物被膜对营养物质具有一定的选择性。由此得出，在25℃或30℃条件下，TSB和BHI培养基质量分数为0.8%时混合生物被膜生长较好，质量分数为3.2%～6.4%时，混合生物被膜被有效抑制。

图1　不同培养温度下TSB（A）和BHI（B）质量分数对混合生物被膜形成能力的影响Fig.1 Effect of TSB（A）and BHI（B）concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

2.2不同培养温度下NaCl质量分数对混合生物被膜形成能力的影响

由于生物被膜在非生物表面的形成给食品工业造成了重大隐患，因此控制生物被膜的生长对食品工厂至关重要。高浓度NaCl溶液可以产生渗透压，让细菌细胞脱水，导致其失水死亡，由此推断NaCl溶液可以有效抑制生物被膜的生长。因此，本实验研究了NaCl质量分数对混合生物被膜的影响，以期为开发安全有效的生物被膜清除方案提供基础数据。不同温度下NaCl质量分数对混合生物被膜形成能力的影响结果见图2。由图2可知，随着NaCl质量分数的升高，混合生物被膜的形成量逐渐下降，当NaCl质量分数＞8%时，不同培养温度下金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合生物被膜的生长均受到明显抑制。这一结果与单一菌种生物被膜的研究数据很相近；邓旗等［13］研究报道，当NaCl质量分数为10%时，希瓦氏菌几乎不能形成生物被膜。由此可见，一定含量的NaCl可以十分有效地抑制生物被膜的形成。此外，较低温度条件下（25℃或30℃），NaCl质量分数＞2%时，混合生物被膜的生长受到明显抑制。由此可见，在食品工业中，若有条件使用较高浓度的NaCl溶液来清洗食品接触面并结合环境温度，可以有效预防生物被膜的形成。

图2　不同培养温度下NaCl质量分数对混合生物被膜形成能力的影响Fig.2 Effect of sodium chloride concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

图3　不同培养温度下麦芽糖（a），葡萄糖（b），乳糖（c），蔗糖（d）质量分数对混合生物被膜形成能力的影响Fig.3 Effect of maltose（a），glucose（b），lactose（c），sucrose（d）concentration on OD600nmof mixed-species biofilm at different culture temperature

2.3单一碳源对混合生物被膜形成能力的影响

碳源是调控微生物黏附行为以及生物被膜形成的重要因素，对于控制生物被膜的形成有着重要意义［15］。在单一菌种生物被膜的研究中曾显示，简单碳源在特定的浓度条件下可对金黄色葡萄球菌生物被膜的生长有微弱或较强的诱导作用［16］。为了了解混合生物被膜在不同碳源条件下的特性，研究了食品中四种常见碳源（麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖）在不同温度下对混合生物被膜形成能力的影响，结果（见图3）可知，不同温度下混合生物被膜的形成量随糖质量分数增加而呈现上升趋势，说明这四种常见的简单碳源均对混合菌种生物被膜的形成有促进作用。此外，在25℃条件下，麦芽糖和乳糖质量分数由0.2%增至1.4%时，混合生物被膜形成较快，但在此浓度范围内，随着葡萄糖质量分数的增加，混合生物被膜生长呈现缓慢上升的趋势，而蔗糖对混合生物被膜的形成没有显著影响；在30℃条件下，麦芽糖、葡萄糖和乳糖质量分数由0.6%增至1.4%时，混合生物被膜形成较快，而在此浓度范围内，蔗糖略微促进混合生物被膜形成，并在蔗糖质量分数为1.0%时，混合生物被膜形成能力最强（OD600nm为0.6）；在37℃条件下，麦芽糖和乳糖质量分数在0至1.4%范围内，随着糖含量增加，能促进混合生物被膜形成；而随着葡萄糖和蔗糖浓度增加，混合生物被膜呈现波动上升的趋势。由此揭示，从“防重于治”的观点来看，在食品工业中，应尽量清除残留在加工环境中的糖成分，以防止诱导病原微生物生物被膜的形成。

3　结论

培养基成分、温度、盐含量、糖含量等因素均能显著影响金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合生物被膜的生长。在25℃或30℃条件下，TSB和BHI培养基质量分数为0.8%时混合生物被膜生长较好；在25℃、30℃或37℃条件下，NaCl质量分数为8%时能有效抑制生物被膜形成。而不同温度下，简单碳源均对混合菌种生物被膜的形成均有促进作用。因此在食品工业中如牛奶厂、甘蔗汁厂、麦芽糖生产厂等，要结合生产食品的差异性，选择有效的手段控制混合生物被膜的生长，尽可能对加工设备及时清理，减少食品接触表面各种糖分的残留量，从而避免对微生物提供生长的温床，降低损失。

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Effects of culture conditions on the growth of dual-species biofilm formed byStaphylococcus aureusandEscherichia coli

LIU Jingjing，CHEN Jingyu*
（College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

Effects of different factors on the growth of dual-species biofilm，which was formed by the most common foodborne pathogenic bacterial Staphylococcus aureusandEscherichia coli，were studied by microtiter-plate method.The results showed thatS.aureusandE.coliformed high quality biofilms at 25℃or 30℃in 0.8%TSB or BHI medium.The addition of glucose，lactose，maltose，and sucrose improved the growth of the dual-species biofilm，respectively.The formation ability of dual-species was significantly inhibited by adding sodium chloride more than 8%.

Staphylococcus aureus；Escherichia coli；dual-species biofilm；culture condition

TS201.3

0254-5071（2016）07-0020-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.07.005

2016-01-19

国家自然科学基金面上项目（31371716）；北京高等学校青年英才计划项目（YETP0310）

刘晶晶（1990-），女，博士研究生，研究方向为酶工程。

陈晶瑜（1978-），女，副教授，博士，研究方向为食品微生物学。