王锐丽，孙 伟，薛业敏（.信阳农林学院生物与制药工程学院，河南信阳464000；.南京师范大学金陵女子学院，江苏南京0097）

嗜热菌β-葡萄糖苷酶A基因的克隆表达及转化大豆异黄酮糖苷的研究1

王锐丽1，孙 伟1，薛业敏2
（1.信阳农林学院生物与制药工程学院，河南信阳464000；2.南京师范大学金陵女子学院，江苏南京210097）

为获得具有高稳定性和高效转化大豆异黄酮糖苷的β-葡萄糖苷酶A，从嗜热厌氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）JW200基因组DNA中β-葡萄糖苷酶A基因（Te-BglA）进行PCR扩增，构建重组质粒pET-20b-Te-BglA，实现在大肠杆菌Escherichia coli JM109（DE3）的高效表达，经热处理和Ni2+亲和层析纯化达电泳均一，并对纯化的重组酶Te-BglA的酶学性质和动力学参数进行研究。结果表明，以pET-20b为载体成功实现基因Te-BglA在E.coli JM109（DE3）细胞中的表达，获得重组酶Te-BglA。以对硝基苯酚-β-葡萄糖苷（pNPG）作为底物，重组酶Te-BglA的最适温度和最适pH分别为80℃和7.0，Km与Vmax值分别为（0.78±0.02）mmol/L和（66.45±0.22）μmol/（min·mg）。以天然产物水杨苷作为底物时，Km与Vmax值分别为（5.18±0.10）mmol/L和（131.60±1.73）μmol/（min·mg），说明重组酶Te-BglA表现出对pNPG更好的专一性，对天然底物也有较好的亲和力。将酶在65℃保温3 h仍有90%的残留活性，在pH 4.6～7.8区间重组酶Te-BglA保持较高的稳定性。高效液相色谱法（HPLC）分析酶解大豆粉的结果表明，重组酶Te-BglA在65℃作用3 h能有效的将大豆异黄酮糖苷形式转化为异黄酮苷元形式，酶解100 g大豆粉后大豆黄素和染料木素的产量分别达到26.2 mg/g和56.1 mg/g。

β-葡萄糖苷酶；酶学性质；大豆异黄酮糖苷；苷元

大豆异黄酮因具有抗肿瘤作用、缓解更年期综合征、抗辐射、延缓衰老等功效而成为国内外研究热点［1-3］。目前研究发现的12种大豆异黄酮根据结构的不同分为两大类：游离型苷元（染料木素、大豆素和黄豆黄素，占有比例少）和结合型糖苷，约占总量的97%～98%。……