张海燕姜海娇祝 迪李建华吕庆杰

（1辽宁省计划生育科学研究院，2沈阳化工研究院有限公司，3中国医科大学附属第一医院病理科，4中国医科大学附属盛京医院病理科，沈阳 110004）



恶性腹腔积液中卵巢癌肿瘤细胞标志物的免疫细胞化学分析

张海燕1姜海娇2祝 迪3李建华3吕庆杰4*

（1辽宁省计划生育科学研究院，2沈阳化工研究院有限公司，3中国医科大学附属第一医院病理科，4中国医科大学附属盛京医院病理科，沈阳 110004）

目的 探讨在恶性腹腔积液中卵巢癌细胞的多种标志物表达情况及分子生物学意义。方法 选取恶性腹腔积液中卵巢癌患者102例，采用免疫细胞化学方法检测细胞角蛋白7（Cell Keratin 7，CK7）、卵巢癌相关抗原（Ovarian Cancer Antigen，CA-125）、癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）、钙网膜蛋白（Calretinin，CR）、C-erbB-2、雌激素受体（estrogen receptor，ER）及孕激素受体（progesteron receptor，PR）表达。结果 102例发生恶性腹腔积液的卵巢癌患者中，98例经过标准化疗1～2个疗程，手术组织病理证实为上皮性卵巢癌，26例发生大网膜或腹膜转移，其中卵巢癌相关标记物CK7阳性表达率为95.1%，CA-125的阳性表达率为88.2%，CEA的阳性表达率为7.8%；CR的阳性表达率为25.5%，但在发生转移的卵巢癌细胞中全部表达；与预后相关的C-erbB-2的阳性表达率为30.4%，ER和PR的阳性表达率分别为50.9%和42.1%。结论 根据各标志物蛋白表达情况，不仅可以诊断卵巢癌细胞并且也可以初步评估其转移情况和恶性程度，并对临床治疗和预后判断提供参考依据。

恶性腹腔积液；卵巢癌；CK7；CA-125

卵巢癌是最常见的妇科肿瘤之一，也是引起妇科肿瘤死亡的主要原因，上皮性卵巢癌约占卵巢恶性肿瘤的85%，腹水是上皮性卵巢癌常见体征，也是晚期的表现之一［1］。腹水常常是由于盆腔及腹腔转移，组织学分级差，淋巴转移等因素有关，腹水中常伴有癌细胞的脱落［2-3］，因此当对腹水进行脱落细胞的病理检测时，就需要对其中的肿瘤细胞进行诊断及鉴别诊断，并对转移特征、恶性程度与预后等临床特征进行初步判断。

细胞角蛋白7（cell keratin 7，CK7）在卵巢和肺等上皮呈阳性表达，而在胃肠道上皮阴性，可作为鉴别诊断指标［4］，与卵巢癌相关抗原（ovarian cancer antigen，CA-125）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）联合可共同诊断卵巢癌细胞［5］。钙网膜蛋白（calretinin，CR）是诊断间皮瘤的有用的标志［6］，通过检测其在卵巢癌细胞中的表达可来了解卵巢癌的转移特征。在上皮性卵巢癌中C-erbB-2过表达比例越高，则临床分期越晚，且其生物学行为和预后就越差。雌激素受体（estrogen receptor，ER）和孕激素受体（progesteron receptor，PR）的检测有助于指导临床治疗［7］。本研究对卵巢癌恶性腹腔积液中CK7、CA-125、CEA、calretinin，CR、C-erbB-2等肿瘤细胞相关标志物及有助于了解其恶性程度和预后的ER和PR进行免疫细胞化学检测，从而为卵巢癌的诊断、转移、预后的判断及其治疗的指导提供参考依据。

材料和方法

1 临床样本

收集2011到2014年中国医科大学附属第一医院病理科、附属盛京医院病房及门诊的恶性腹腔积液共1387例，引起腹水的病变包括炎症，结核，胃肠道肿瘤转移，间皮瘤等，取其未接受过治疗的102例卵巢癌患者恶性腹腔积液作为研究对象，其中98例后经过标准化疗1～2个疗程，经临床检查及术后组织病理和免疫化学染色诊断为上皮性卵巢癌，其中26例发生大网膜或腹膜转移。102例中，年龄从21至78岁，平均年龄为55岁。

2 液基细胞薄层检测技术（ThinPrep Cytology Test，TCT）

收集新鲜腹水25ml左右，室温下2000r/min离心5min，弃去上清液，加入清洗液再次离心后，弃去上清液，取底层沉淀细胞与保存液混合后，机器Thinprep5000自动制片，并进行染色和镜下诊断。

3 切片制备与HE染色

TCT常规制片，诊断后，每份标本收集新鲜腹水200ml左右，室温下，2000r/min离心5min，取细胞沉渣，经95%乙醇固定12h后梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片，HE染色后，镜下观察，筛选切片。

4 免疫细胞化学染色与结果判定

切片常规脱蜡、脱水、高温高压法抗原修复后进行免疫细胞化学EnVision法染色（具体染色步骤按照试剂说明书进行），用PBS液代替一抗作为阴性对照。

结果判定：免疫反应阳性细胞必须具备细胞结构清晰，阳性颗粒定位好，着色明显高于背景的特点，显微镜下表现为胞膜、胞浆或胞核的棕褐色或褐色颗粒着色。

结 果

恶性腹腔积液经TCT及HE镜下初步诊断为可疑瘤细胞（图1A，1B），并进行卵巢癌组织的HE及CA-125的免疫组织化学染色进一步验证（图2A，2B）。

表1　恶性腹腔积液中卵巢癌细胞的CK7、CA-125、CEA、CR、C-erbB-2、ER及PR的表达率Table 1 The positive expression rate of CK7、CA-125、CEA、CR、C-erbB-2、ER and PR from the malignant ascites of ovarian cancer patients

图1　卵巢癌患者恶性腹腔积液中细胞的组织学和免疫细胞化学染色。A，恶性腹腔积液TCT涂片中卵巢癌细胞巴氏染色；B：，同例恶性腹腔积液的石蜡包埋切片HE染色中的卵巢癌细胞；C，同例恶性腹腔积液中卵巢癌细胞的CK7免疫反应阳性表达；比例尺，50μmFig.1 The histological and immunocytochemical staining of the cells from malignant ascites fluids of ovarian cancer patient.A，HE staining of TCT sample cells from malignant ascites fluids of ovarian cancer；B，HE staining of ovarian cancer cells from malignant ascites fluids of the same case；C，The positive expression of CK7 immunocytochemical staining in the cells from malignant ascites fluids of the same patient case；scale bar，50μm

免疫细胞化学染色显示，卵巢癌相关标志物CK7表达阳性（图1C），CA-125阳性部位为细胞膜（图3A），表达率分别为95.1%和88.2%（表1）；癌胚抗原（CEA）阳性表达部位为细胞质（图3C），其表达率相对较低，为7.8%（表1），所以对恶性腹腔积液中的卵巢癌细胞进行诊断时，需要三者联合进行检测，以提高诊断的准确性。发生腹腔转移的卵巢癌细胞，其间皮细胞特异性标记物（CR）全部阳性表达，阳性部位为细胞质（图3B），我们认为卵巢癌细胞在转移和浸润的过程中发生了分子生物学的改变，使其更有利于自身的存活。卵巢癌预后参考指标C-erbB-2、ER及PR也呈阳性表达，阳性部位定位于细胞质、细胞核及细胞核（图4），其表达率分别为30.4%、50.9%、42.1%（表1），C-erbB-2的表达说明发生腹腔转移的卵巢癌细胞具备一定的恶性程度。

图2　卵巢癌组织的HE染色（A）及CA-125的免疫组织化学染色（B）。比例尺，50μmFig.2 HE staining（A）and immunohistochemical staining of CA-125（B）in ovarian cancer tissue.Scale bar，50μm

图3　同例恶性腹腔积液中卵巢癌细胞的 CA-125（A）、CR（B）、CEA（C）膜浆的阳性表达。比例尺，50μmFig.3 The positive expression of CA125（A），CR（B），CEA（C）from the cells in the malignant ascites fluids of the same patient case.Scale bar，50μm

图4　同例恶性腹腔积液中卵巢癌细胞的C-erbB-2（A）、ER（B）及PR（C）阳性染色。比例尺，50μmFig.4 The expression of C-erbB-2（A）、ER（B）and PR（C）from the cells in malignant ascites fluids of the same patient case.Scale bar，50μm

讨 论

卵巢癌患者易出现恶性腹腔积液，通过对恶性腹腔积液中肿瘤细胞的免疫化学分析，可有助于对肿瘤进行诊治和疗效观察。本研究对恶性腹腔积液中卵巢癌细胞进行免疫细胞化学的检测，发现其上皮性标志物CK7表达率高达95.1%，有研究表明，与转移性卵巢癌相比，CK7在原发性卵巢癌中具有更高的表达率［8］。卵巢癌的肿瘤标记物CA-125表达率也高达88.2%，CA-125是1983年由Bast等从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体OC125结合的一种糖蛋白，来源于胚胎发育期体腔上皮，在正常卵巢组织中不表达，其诊断的敏感性较高，晚期卵巢癌患者的血清CA-125异常升高率达80%［9］。CK7与CA-125的联合检测，对于恶性腹腔积液中，原发性卵巢癌的鉴别诊断具有重要参考价值，CEA是一种非特异性肿瘤标志物，广泛存在于消化系统肿瘤患者的体内，CEA在卵巢癌中可以表达，但它不是卵巢癌的特异性肿瘤标志物，在妇科恶性肿瘤的治疗中也具有一定的参考价值，但因为阳性率低，最好结合其它指标来共同判断肿瘤性质［10］，在本研究中也证实CEA阳性率表达在卵巢癌细胞中较低，需要结合CK7与CA-125来一起判断肿瘤细胞的性质。

在本研究中，26例卵巢癌患者发生了腹腔转移，转移癌细胞种植于大网膜或腹膜等处，其间质细胞标记物CR全部表达，我们推测肿瘤细胞在新的病灶处生长的过程中与周围的间质细胞发生了生物分子学特征上的融合，从而更有利于其在新的环境中生长。此外，肿瘤细胞在侵袭转移的过程中，可能具备了间质细胞的某些特性，从而更有利于自身的转移，具体原因还需我们进一步研究。但我们可以利用这一分子标记的表达，来评估卵巢癌细胞的转移情况，进而为治疗提供参考。

C-erbB-2为一种原癌基因，在多种人类肿瘤，特别是上皮性肿瘤，存在基因扩增和蛋白的表达异常。有研究表明，在卵巢癌的组织中，从在C-erbB-2基因的过度表达，从而是细胞异常增值，促进肿瘤发生发展，且其表达率在低分化癌中高于高分化癌，可见其与恶性程度相关［11-12］。本研究中C-erbB-2的表达率也有30.4%，这说明腹水中的肿瘤细胞也具备高度恶性的特征，预示着不良预后。ER和PR也具有一定比例的表达，在免疫组织化学的研究中发现，不同的卵巢癌组织学类型，ER和PR的表达具有一定的差异性，但发现PR的表达是预后较好的一个重要指标，同时ER和PR的表达是激素依赖性肿瘤对内分泌治疗敏感性好的依据［13］。

卵巢癌恶性腹腔积液中的脱落细胞学检查方法简单、快速、患者痛苦小，是一项必不可少的重要检查手段。癌细胞的检测对鉴别良、恶性、分期、治疗和预后等均有关，但腹水中癌细胞的检出率也可能受一些因素的影响，如临床期别、组织学类型、腹腔转移、肿瘤有无破溃、癌肿是否外生型等有关［14］，卵巢癌腹水的液基细胞学与免疫细胞化学技术相结合在疑难腹水鉴别诊断中可以起到关键作用，在我们的研究中，发现有部分病例的恶性腹腔积液中的卵巢癌细胞可以同时表达多种因子，这说明肿瘤细胞在转移过程中发生了多样性的变化，多种抗体的联合应用可有助于鉴别诊断腺癌细胞的恶性程度，转移情况及为治疗与预后提供参考价值。

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Immunocytochemical analysis of markers for
tumor cells from malignant ascites of ovarian cancer

Zhang Haiyan1，Jiang Haijiao2，Zhu Di3，Li Jianhua3，Lv Qingjie4*
（1Liaoning Research lnstitute of Family Planning，2Shenyang Research Institute Of Chemical Industry，3Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of China Medical University，4Department of Pathology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the expression and biological significance of ovarian cancer cell markers from malignant ascites.Methods In 102 cases of malignant ascites of ovarian cancer，the expressions of CK7，CA-125，CEA，CR，C-erbB-2，ER and PR were detected by immunohistochemical staining.Results After 1-2 cycles of standard chemotherapy，surgical pathology confirmed epithelial ovarian cancer in 98 of the 102 cases，26 with omental or peritoneal metastasis.positive rates of CK7，CA-125，CEA，CR，C-erbB-2，ER，and PR were vespectively 95.1%，88.2%，7.8%，25.5%，30.4%，50.9%and 42.1%.Conclusion The protein expression of the markers can give a preliminary assessment of the degree of malignancy and metastasis of tumor cells，thus providing references for clinical treatment and prognosis.

malignant ascites；ovarian cancer；CK7；CA-125

R361+.3

A

10.16705/j.cnki.1004-1850.2015.06.

2015-12-13 〔修回日期〕2016-03-26

张海燕，女（1974年），汉族，副主任医师

（To whom correspondence should be addressed）：lvqjie@163.com