周商言，张 曼

（首都医科大学附属北京世纪坛医院医学检验科，尿液细胞分子诊断北京市重点实验室，北京　100038）

AG490在人膀胱癌细胞株Pumc-91中STAT3的抑制作用

周商言，张 曼

（首都医科大学附属北京世纪坛医院医学检验科，尿液细胞分子诊断北京市重点实验室，北京100038）

目的 研究不同孵育时间以及不同浓度的STAT3特异性抑制剂AG490作用于人移形上皮膀胱癌细胞株（pumc-91）中STAT3信号通路蛋白表达的条件优化。方法 分别在0、24、36、48、60h收集细胞并提取细胞蛋白，应用Western Blot对各组中STAT3的蛋白表达水平进行半定量分析；加入100μmol/L AG490作用于pumc-91细胞，分别用0、50、100、200μmol/L的AG490处理pumc-91细胞48h后，应用Western Blot检测各组中STAT3的蛋白表达水平。结果 STAT3蛋白的表达随AG490作用时间延长而逐步降低，在作用时间为48h时，差异有统计学意义（P＜0.05）。STAT3蛋白的表达明显随AG490浓度的升高而逐步下降，在浓度为200μmol/L时差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 AG490通过抑制STAT3蛋白的表达，成功抑制了STAT3信号通路的活性，而且其抑制作用具有时间和剂量的依赖性，AG490在作用浓度为200μmol/L和作用时间为48h的条件下，有效的抑制了STAT3蛋白在pumc-91细胞系中的表达。

膀胱癌； STAT3； AG490； 蛋白免疫印迹

DOI：10.11748/bjmy.issn.1006-1703.2016.04.028

收稿日期：2016-01-26；修回日期：2016-02-02

基金项目：尿液细胞分子诊断北京市重点实验室（Z151100001615060）；北京市中医药管理局（2014-ZYJ04）

作者简介：周商言（1986—），女，硕士在读，主要从事蛋白质组学研究。

通讯作者：张曼，教授，博士生导师。E-mail：mzhang99@aliyun.com

信号传导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是一种存在于胞质中的转录因子，当细胞因子或生长因子激活其上游JAK2激酶后，使STAT3分子酪氨酸磷酸化，磷酸化的STAT3以二聚体形式转移至胞核调节靶基因的转录。STAT3信号转导通路在肿瘤组织中的异常激活与细胞异常增殖和恶性转化密切相关［1-4］。AG490，即α-氰基-（3，4-羟基）N-苄苯乙烯胺，是一种JAK/STAT通路特异性阻断剂，通过选择性拮抗JAK2酪氨酸磷酸化，特异性阻断各种细胞因子引起的JAK2和下游分子STAT3的磷酸化激活，从而阻断JAK/STAT信号通路。研究显示，AG490能够有效阻断STAT3信号通路的活化，进而抑制肿瘤细胞的生长率，促进其凋亡［2］。关于AG490作用与人移行细胞膀胱癌细胞株pumc-91的研究尚未见到相关报道。本实验研究不同浓度及不同孵育时间的AG490对人膀胱癌pumc-91细胞中STAT3蛋白表达的影响，旨在探讨AG490作用于pumc-91细胞株的最佳条件，为我们后续的深入研究打基础。

材料与方法

1 材料

人膀胱癌细胞pumc-91由北京协和医院细胞室提供；PRMI-1640购自美国Gibco公司。胎牛血清购自北京鼎国昌盛公司。0.25%胰酶和DMSO购自Genview公司。阿霉素和 AG490购自美国 Sigma公司。STAT3兔单克隆抗体购自美国Abcam公司。

2 方法

2.1细胞培养与处理

细胞培养：人膀胱癌pumc-91细胞株用含10%的胎牛血清的RPMI1640于37℃，5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。

AG490对STAT3活性的时间梯度作用：取对数期细胞接种于培养瓶中，实验组加入AG490 100μmol/L，对照组加入1‰ DMSO，在培养24h、36h、48h、60h后分别提取相应实验组细胞。

AG490对STAT3活性的浓度梯度作用：将AG490溶于DMSO，溶解后的终浓度为100μmol/L。取对数期生长细胞制备成单细胞悬液，使其密度为1×105/mL接种于培养瓶中，细胞贴壁后分别加入50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L AG490。设正常对照组，加入含有1‰DMSO的培养液，培养48h后收集细胞。

2.2Western blot方法检测STAT3蛋白表达

用RIPA裂解液细胞提取总蛋白，取100μg细胞总蛋白经SDS聚丙烯酰胺凝胶（8%分离胶，5%浓缩胶）进行分离后，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加入1∶1000稀释的一抗STAT3、β-actin 4℃孵育过夜。PBST漂洗3次，每次20min，室温孵育二抗90 min，PBST漂洗，DAB显色，所有实验重复三次［5］。

3 统计学分析

运用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。所有数据以均数±标准差来表示，组间均数的比较采用方差分析方法，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 不同时间点AG490对STAT3信号通路的阻断作用

研究AG490作用不同时间对STAT3活性的影响，利用Western Blot检测0h、24h、36h、48h、60h各时间点STAT3的活性水平，Lane 1D凝胶分析系统测定条带灰度值，以β-actin作内参对各组数据进行半定量分析，实验重复三次，见图1。

AG490各时间点的STAT3/β-actin的灰度比值见表1，其中48h和60h时间组与对照组的灰度比值差异具有统计学意义（P＜0.05），24h和36h组差异无统计学意义（P＞0.05）。

2 不同浓度AG490对STAT3信号通路的阻断作用

为了明确不同浓度的AG490对STAT3活性的影响，通过Western Blot检测0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L各浓度组中的STAT3的蛋白表达量，实验重复三次，见图2。

各浓度组的STAT3/β-actin的灰度比值见表2，其中200μmol/L浓度组与对照组的灰度比值差异具有统计学意义（P＜0.05），50μmol/L和100μmol/L浓度组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2　不同浓度AG490作用　48h后各浓度组的STAT3/β-actin的灰度比值（x±s）

讨 论

膀胱肿瘤是泌尿生殖系统中最常见的肿瘤之一。在全球范围内，膀胱癌发病率排在恶性肿瘤的第11位，目前治疗以手术为主，术后结合膀胱腔内灌注化疗药物辅助治疗，但术后极易出现化疗耐受和病情复发，这是膀胱癌治疗过程中的难题［5-6］。寻求能提高化疗敏感性和减少复发的方法是目前研究的热点。

STAT3是近年来研究非常活跃的转录因子，在外界刺激作用下STAT3经酪氨酸磷酸化而被激活，活化的STAT3单体通过SH2结构域与另一STAT3分子磷酸化的酪氨酸残基相互作用，形成二聚体进入细胞核，与其特异的DNA反应元件结合，调节下游靶基因的转录如CyclinD1、c-myc和Bcl-xL，对肿瘤细胞的形成、生长、凋亡抑制等过程起着重要的调控作用［1］。近年来研究表明STAT3蛋白在多种肿瘤细胞中存在异常活化，阻断肿瘤细胞中癌基因STAT3信号传导通路可以起到治疗肿瘤的作用。Zhang等［7］报道敲除STAT3或Survivin基因明显抑制T24膀胱癌细胞的增殖。同时还有研究表明，STAT3的异常激活还可能与肿瘤的多药耐药有关。Lo等［8］研究发现在低分化神经胶质瘤中，p-STAT3的上调与药物抵抗有密切联系，抑制STAT3信号通路后胶质瘤细胞对化疗的敏感性显著提高。而在乳腺癌中，STAT3沉默后，耐阿霉素细胞MCF-7凋亡率升高提示STAT3基因的高表达和活化是乳腺癌耐阿霉素的机制之一，抑制STAT3的表达与活化可有效逆转乳腺癌的阿霉素耐药性，其机制可能与促进细胞凋亡有关［9］。Liu等［10］发现大根香叶酮下调JAK2/STAT3活性，调控Bcl-2和p53，从而调节STAT3的蛋白表达，促进肝癌细胞的凋亡。以上研究结果表明，抑制或完全沉默STAT3的表达可能是一种很有前途的抗癌治疗策略，但目前STAT3信号通路在膀胱癌中演变以及耐药过程中的具体分子机制尚不明确。

STAT3特异性抑制剂AG490是一种人工合成的苯亚甲基丙二腈的脂类衍生物，分子式为C17H14N2O3，分子量为294.3，结构与酪氨酸类似，通过与受体酪氨酸激酶竞争结合位点，从而特异性阻断STAT3信号通路。目前AG490已广泛用于多种肿瘤的治疗，如白血病、淋巴瘤、肝癌、膀胱癌等［8］。Eriksen等［11］报道AG490在抑制皮肤T细胞淋巴瘤细胞STAT蛋白活化的同时，还抑制了细胞因子诱导肿瘤细胞的有丝分裂，下调Mcl-1表达，从而促进肿瘤细胞的凋亡。有研究指出，AG490可通过阻断STAT3信号通路抑制膀胱癌细胞的增殖，促进其调亡。姚林方等［2-3］研究发现AG490明显抑制膀胱癌细胞增殖和干细胞克隆形成，使细胞周期阻滞的同时，使p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Cyclin D1、bcl-xL蛋白表达水平明显下降，裸鼠移植瘤在AG490的作用下明显缩小。AG490阻断STAT3通路后，VEGF的表达受到抑制，移植瘤的血管生成显著减少。Joung Y H等［12］报道 AG490与二甲基亚砜联合使用通过下调STAT3、STAT5b、IGF-1R、VEGF和VEGF-R2信号分子，抑制VEGF mRNA的表达来抑制人膀胱癌的生长、进展和转移。

本研究中，用100μmol/L浓度AG490作用不同时间后，STAT3的表达量随着药物时间延长均有下降，AG490作用时间为48h时与对照组中STAT3蛋白的灰度比值分别为0.101±0.020和0.150± 0.026，STAT3的表达量明显低于对照组，经分析差异有统计学意义（P＜0.05）。用不同浓度的AG490作用于pumc-91膀胱癌细胞48h后，STAT3的表达量随着药物浓度递加均有下降，AG490作用浓度为200μmol/L时与对照组的灰度比值分别为0.173± 0.052和0.265±0.020，STAT3的表达量明显低于对照组，经分析差异有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，AG490在作用浓度为200μmol/L和作用时间为48h的条件下，可有效抑制STAT3蛋白的表达。AG490的作用机制是通过抑制STAT3磷酸化来降低STAT3蛋白的表达量，从而阻断STAT3信号通路。本实验中在AG490的作用下pumc-91细胞中STAT3蛋白明显降低，有效阻断STAT3的持续激活，成功抑制STAT3信号通路转导，而且AG490的作用具有剂量和时间的依赖性。这提示我们可以利用AG490对膀胱癌发生与发展以及耐药的产生机制进行进一步研究。

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（李 凌编辑）

The Inhibition of AG490 on Human Bladder Cancer Cell Line Pumc-91

ZHOU Shang-yan，ZHANG Man
（Clinical Laboratory Medicine，Beijing Shijitan Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100038，China）

Objective To optimize the best condition of the effect of AG490，a STAT3 inhibitor on human transition cell carcinoma of the urinary bladder cell line（pumc-91）.Methods Pumc-91 cells were given AG490 at 100μmol/L and then cultured separately for 0，24，36，48 and 60 hours.The others were treated with 0，50，100，200μmol/L of AG490 respectively and cultured for 48h.Western blot was adopted to detect the expression of STAT3.Results With the growth of the action time of AG490，the expression of STAT3 protein decreased gradually.When the action time was 60 h，the difference was statistically significant（P＜0.05）.With the increase of the concentration of AG490，the expression of STAT3 protein decreased gradually.In the concentration of 200μmol/L，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion By inhibiting the expression of STAT3 protein，AG490 can successfully inhibit the active of STAT3 signaling pathways in a time and dose dependent manner.When the concentration is 200μmol/L and the action time is 48h，AG490 can inhibit the expression of STAT3 protein in pumc-91 cell effectively.

Bladder cancer； Signal transducer and activator of transcription 3（STAT3）； AG490； Western blotting