赵亚，李红武，师长宏，张彩勤，赵勇，刘佩娟，白冰，唐娟，白杰英，张海*

(1.第四军医大学实验动物中心，西安　710032；2.北京艾德摩生物技术有限公司，北京　101111；3.第四军医大学细胞工程中心，西安　710032； 4.军事医学科学院实验动物中心，北京　100071)



基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

赵亚1，李红武2，师长宏1，张彩勤1，赵勇1，刘佩娟1，白冰1，唐娟3，白杰英4，张海1*

(1.第四军医大学实验动物中心，西安710032；2.北京艾德摩生物技术有限公司，北京101111；3.第四军医大学细胞工程中心，西安710032； 4.军事医学科学院实验动物中心，北京100071)

目的应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因，构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列，分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成， sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞，受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠，首建鼠(F0)与野生型小鼠交配获得F1代小鼠，突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录，mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后，获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型，分别是10 bp和11 bp的缺失突变；而Rag2只有一个基因型，为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比，小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后，肿瘤生长良好，且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。……