黄娟 王立琼 程首超 程学文 赵红玲 罗运春★

哮喘小鼠肺组织中Galectin-3和核因子NF-κB的表达及意义

黄娟 王立琼 程首超 程学文 赵红玲 罗运春★

目的 探讨半乳糖凝集素3（Galectin-3）和核转录因子NF-κB在哮喘小鼠模型肺组织中的作用及相关性。方法 用卵清白蛋白建立哮喘模型。BALB/c小鼠随机分为三组：正常对照组、哮喘组、地塞米松治疗组，每组10只。留取支气管肺泡灌洗液（BALF）进行细胞总数计数和分类计数；应用ELISA法检测BALF中IL-4、IFN-γ浓度，采用免疫组化分别检测和Galectin-3和NF-κB的表达。结果 （1）免疫组化显示，哮喘组肺组织中 Galectin-3蛋白表达和相应的气道上皮NF-κB活化强度均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（2）哮喘组肺组织中Galectin-3 蛋白表达与相应的气道上皮NF-κB活化及BALF中IL-4浓度均成正相关（P＜0.01）。结论 哮喘小鼠肺组织NF-κB和Galectin-3表达均增加，NF-κB可能上调Galectin-3的表达。

哮喘 NF-κB 半乳糖凝集素-3 IL-4 IFN-γ

半乳糖凝集素-3（gal-3），是半乳糖家族最重要的成员之一，是近年来被认识到新的炎症因子和生物学标记物，其参与炎症反应，调节细胞生长，抗凋亡和介导细胞粘附等多种生物学功能［1］。核转录因子κB（NF-κB）是一种多功能核转录因子，具有广泛生物学活性，激活后可调控多种炎性蛋白的合成，参与哮喘的炎症反应和气道重塑。两者在哮喘小鼠模型中的关系国内未见报道。2014年6月至2015 年6月作者采用免疫组化法研究哮喘小鼠气道上皮NF-κB活化情况及肺组织中Galectin-3的表达，分析其在哮喘发生发展中的作用及相关性，为进一步探讨哮喘的发病机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1哮喘小鼠模型的建立 SPF级BALB/c雄性小鼠30只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，21～35d，体重14～18g，随机分为正常对照组（A组），哮喘组（B组），地塞米松治疗组（C组），每组各10只。采用V级卵清白蛋白OVA制备模型，哮喘模型的制作参照文献［2］的方法略作改进。分致敏、激发两个阶段，第8天和第21天腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al （OH）3凝胶致敏，各1次，共2次，第32天开始使用空气压缩雾化器向置于密闭有机玻璃容器内的小鼠喷雾1%OVA，每天吸入30min，连续定时激发1周。对照组以生理盐水代替OVA致敏和激发。

1.2实验方法 各组末次激发＜24h处死，眼球动脉取血，收集血清，每只小鼠左肺迅速留取肺组织，部分透明，石蜡包埋连续切片，用以光电镜标本制作和免疫组化，右肺进行支气管肺泡灌洗并留取支气管肺泡灌洗液（BALF），2000r/min离心15min，取上清液-80℃保存Eppendorf管用以检测IFN-γ和IL-4浓度。支气管肺泡灌洗小鼠收取BALF，细胞分类计数使用瑞氏染色。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定BALF中IFN-γ、IL-4浓度，测定方法按试剂说明书进行操作。免疫组化SP法测肺组织中NF-κB活化值和Galectin-3的表达，测定方法按试剂说明书进行操作。

1.3统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。计量资料以（±s）表示。正态分布及方差齐时，组间均数比较采用单因素方差分析（one way-ANOVA），两两比较方差齐用LSD检验，方差不齐用Dunnett'T3检验，两变量的相关性采用Pearson相关分析法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1HE染色观察 哮喘组小鼠肺组织切片HE染色可见肺内支气管黏膜下、肺内支气管及血管周围较多炎性细胞浸润，以EOS、Lym、Neu为主，黏膜下水肿，黏液腺增生，气道上皮多处断裂和上皮细胞的脱落，肺间质和支气管腔内可见炎性细胞渗出和分泌物，支气管壁略显增厚和基底膜轻度增厚且不规则，细支气管平滑肌轻度肥大。地塞米松治疗组小鼠肺组织炎性细胞浸润等病理改变较哮喘组明显减轻。

2.2PAS染色观察 正常对照组小鼠肺组织切片PAS染色未见黏液分泌；哮喘组PAS染色可见气道上皮杯状细胞增生肥大，大量黏液形成黏液栓；地塞米松治疗组肺组织PAS染色与哮喘组相比杯状细胞增生不明显，黏液分泌明显减少。

2.3电镜观察 正常对照组小鼠显示正常肺泡Ⅱ型上皮细胞，支气管纤毛上皮细胞纤毛排列齐整，肺泡隔结构正常，表面微绒毛丰富；未见淋巴细胞及嗜酸性粒细胞附壁及浸润；肺细小动脉内膜、中膜、外膜清晰，内皮细胞扁平，平滑肌细胞之间有散在的胶原纤维，哮喘组小鼠电镜观察显示肺间质有EOS浸润，肺泡Ⅱ型上皮细胞水肿，核轻度固缩，胞浆部分内质网扩张，表面微绒毛部分脱落，线粒体轻度肿胀。支气管纤毛上皮细胞纤毛排列稀疏，有断裂、融合现象；肺泡腔及血管壁有多个巨噬细胞浸润。

2.4各组小鼠BALF中细胞计数与分类计数的比较 见表1。

表1　各组小鼠BALF中细胞总数和分类计数（±s）

表1　各组小鼠BALF中细胞总数和分类计数（±s）

注：与A组比较★P＜0.01；与B组比较△P＜0.05，#P＜0.01

细胞分类计数（%）Lym　NEU　Mф　EOS A组　10　22.40 ±1.0　6.35±0.95　5.13±0.48　98.75±.6.23　0.61±.0.03 B组　10　100.28±2.24★　11.61±0.35★　11.87±0.48★　66.90±9.75★　11.33±.0.72★C组　10　58.40 ±4.43★#　9.80±1.14★#　8.91±1.26★△　70.54±10.81★△　6.31±.0.32★#组别　n　细胞总数（×107）

2.5各组BALF中IL-4、IFN-γ浓度的变化 见表2。

表2　各组小鼠BALF中IFN-γ、IL-4浓度的变化［pg/ml，（±s）］

表2　各组小鼠BALF中IFN-γ、IL-4浓度的变化［pg/ml，（±s）］

注：与A组比较★P＜0.01；与B组比较△P＜0.05实验过程中因技术原因标本不合格，故鼠数与原来每组只数不一致。

组别　鼠数（只）　IFN-γ　IL-4 A组　8　18.85±7.32　37.14±3.70 B组　8　6.20±4.38★　148.87±30.90★C组　8　8.65±3.39★　72.42±7.96★△

2.6肺组织中Gal-3蛋白的变化及NF-κB活化的比较 见表3。相关性分析显示，小鼠肺组织中Gal-3表达与BALF中IL-4浓度（ r=0.791，P＜0.01）及气道上皮NF-κB活化均成正相关（r=0.836，P＜0.01）。

表3　各组小鼠肺组织Gal-3蛋白表达情况（±s）

表3　各组小鼠肺组织Gal-3蛋白表达情况（±s）

注：与A组比较★P＜0.05，#P＜0.01；与B组比较△P＜0.01

组别　鼠数（只）　Galectin-3蛋白　NF-κB活化值A组　10　0.18±0.03　0.17±0.03 B组　10　0.32±0.01#　0.34±0.03# C组　10　0.22±0.02△#　0.21±0.01★△

3　讨论

Gal-3由一个长的N末端结构域（调节区）和C末端的单一糖识别域（CRD结构域），其羧基端是糖识别域组成。其是一种多效蛋白，表达与肺、肠、皮肤的上皮细胞、成纤维细胞及各种炎症细胞表面。通过与其糖结合物配体结合，使其N末端调节区形成寡聚化参与调节细胞黏附，单核巨噬细胞趋化（包括肺泡巨噬细胞）、调节细胞的生成和凋亡，参与内皮细胞和血管生成及信号传导等。Gal-3是蛋白质复合体，包括IgE的一部分，Gal-3参与lgE及其受体结合能触发肥大细胞和嗜碱性细胞活化，刺激中性细胞过氧化物酶产生，激活NADPH氧化酶，促进单核细胞脂多糖途径诱导IL-1产生，并诱导单核细胞向炎症部位趋化，这些发现显示Gal-3在炎症反应中发挥重要作用。Saegusa［3］等在哮喘小鼠模型中发现，与Galectin-3（+/+）小鼠相比，Galectin-3（-/-）哮喘小鼠嗜酸性粒细胞浸润减少，血清lgE减少，黏液分泌也显著减少，同时减轻上皮下的纤维化、平滑肌厚度和支气管炎周围血管生成，减轻气道的重塑，提示Gal-3加重的哮喘的气道炎症和气道重塑。Pierluig［4］等最新的研究显示：通过对严重哮喘的患者进行奥马珠单抗（重组化、人源化抗lgE单克隆抗体）治疗后发现，Gal-3参与急慢性炎症和组织纤维化的发生，在初始阶段的过敏反应，Gal-3刺激炎症通过巨噬细胞释放和IgE产生增加，最终结果是由胶原蛋白和纤连蛋白沉积形成的气道重塑。Gal-3可以被认为是一个可靠的生物标志物来预测严重哮喘患者气道重塑。

本资料显示哮喘小鼠肺组织中Gal-3蛋白的表达较对照组显著增高，其主要表达于支气管上皮细胞及散在的炎性细胞，相关性分析显示Gal-3mRNA含量与BALF中IL-4浓 度（r=0.761，P＜0.01）、BALF中细胞总数（r=0.821，P＜0.01）成正相关，与BALF中IFN-γ浓度（r=-0.634，P＜0.01）成负相关。提示急性哮喘发作期，支气管上皮细胞及散在的炎性细胞释放炎症因子Gal-3明显增多。与文献报道一致［3］，蒋鲲［5］等进一步研究哮喘患儿的支气管肺泡灌洗液发现Gal-3的表达明显增高。

NF-κB是一种调控多种细胞基因的快反应转录因子，主要存在于胞浆，细胞静息时极少有核表达，多数细胞中以p50 和p65 亚基的二聚体存在，由于其紧密结合的抑制蛋白IB抑制其活性。当活化因子磷酸化I-κB后释放出NF--κB活化转位到核中增强靶基因的表达。在参与哮喘气道炎症的众多因素中，核转录因子NF-κB被公认哮喘关系密切。研究表明哮喘患者气道的重要位点存在活化的NF-κB，从而编码并调控多种炎性蛋白的持续表达［6］。Lorraine等在哮喘患者气管活检细胞中发现NF-κB的升高［7］。Dumic［8］等研究证实NF-κB和c-Jun氨基末端激酶共同参与调节gal-3的表达。且Gal-3基因敲除的小鼠有显著降低的NF-κB的活性Gal-3和减少的炎症细胞。同时，Gal-3的拮抗剂可以下调NF-κB的活性，哮喘发生时，Gal-3可能通过其配体血小板蛋白选择配体1（PSGL-1）的协助发出诱导信号使NF-κB从细胞浆中脱离进入细胞核，再通过Gal-3的表达，内皮细胞和血小板均呈现活化状态并迅速募集，参与炎症反应的应答，进一步加重哮喘的发生。

本资料哮喘模型中NF-κB和Gal-3均表达增加，与文献报道一致。而在地塞米松组中两者的表达均降低。相关分析显示Gal-3的变化趋势和NF-κB的变化趋势一致。两者表达呈正相关性。表明哮喘肺组织中Gal-3 的表达可能由NF-κB所调控，NF-κB可能上调Gal-3 的表达，使炎症进一步扩大。这为哮喘的发病机制及治疗手段提供理论基础，下一步对Gal-3 和NF-κB进行更深入研究，从分子水平上进一步探讨哮喘的发病机制，为评价哮喘炎症反应和寻找新的治疗手段提供依据。

1 Neil C. Henderson，Tariq Sethi .The regulation of inflammation by galectin-3.Immunological Reviews，2009，230： 160～171.

2 李昌崇，张维溪，陈小芳，等.巨嗜细胞炎性蛋白1及其mRNA在哮喘小鼠气道炎症中的作用.中华儿科杂志，2004， 42（2）：90～93.

3 Saegusa J， Hsu DK， Chen HY， et al. galectin-3 is Critical for the development of the allergic inflammation response in a mouse model of atopic dermatitis. Am J Pathol， 2009， 174（3）：922～931.

4 Pierluigi M ， Anna Maria Riccio ，Rossana R，et al. Proteomics of bronchial biopsies： Galectin-3 as a predictive biomarker of airway remodelling modulation in omalizumab-treated severe asthma patients. Immunology Letters，2014，162：2～10.

5 蒋鲲，陈和斌，王莹等.支气管哮喘患儿血清及支气管肺泡灌洗液中半乳糖凝集素-3和转化生长因子-β1的变化.临床儿科杂志，2013：2～15.

6 张娟，徐青.核转录因子-κB与支气管哮喘的研究进展.国际免疫学杂志，2010，33（3）200～204.

7 Hart LA，Krishnan VL，Adcock IM，et al. Activation and localization of transcription factor，nuclear factor -kappaB，in astlrma .Am J Respir Crit Care Med，1998，158（5 Pt 1）：1585～1592.

8 Dumic J，Lauc G，flogel M.Expression of galectin-3 in cells exposed to stress-roles of jun and NF-κB.Cell physiol Biochem， 2000，10（3）：149～158.

Objective To observe the expression of Galectin-3 and NF-κB in the bronchus of a mouse model of asthma. Methods BALB/ c mice were randomly divided into three groups：the control group，asthma group and DXM treated group.In the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin（OVA） challenge Methods. The cell numbers and differentiated cell numbers in BALF were counted by different counting fluids；Application of ELISA Methods to detect concentration IL - 4，IFN -γ in BALF；The protein expression of Galectin-3 and NF-κB were detected by Immuno-histochemistry（IHC）. Results （1）Immunohistochemical staining showed that the protein content of Galectin-3 and airway epithelial NF-κB activation expression in asthma group were significantaly higher than that of the control group；（2）There was a positive correlation between Galectin-3 and NF-κB in lung and IL-4 in BALF（P＜0.01）.

Conclusion Asthma mice lung tissue NF-κB and Galectin 3 expression are increased，the NF-κB may increase the expression of Galectin - 3.

Asthma NF-κB Galectin-3 IL-4 IFN-γ

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