李　娟,卢士玲,王庆玲,*,孙丹丹,侯扶琴

(1.新疆石河子大学食品学院,新疆石河子 832000; 2.新疆喀尔万食品科技有限公司,新疆石河子 832000)



真空包装牛肉冷藏过程理化和微生物变化

李娟1,卢士玲1,王庆玲1,*,孙丹丹1,侯扶琴2

(1.新疆石河子大学食品学院,新疆石河子 832000; 2.新疆喀尔万食品科技有限公司,新疆石河子 832000)

将牛肉真空包装贮藏在4 ℃条件下,每3 d测定其pH、挥发性盐基氮(TVB-N)、菌落总数,并利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电脉(PCR-DGGE)技术来研究其贮藏过程的菌相变化。结果表明:4 ℃条件下,真空包装冷却牛肉菌落总数在12 d超过6.0 lg cfu/g,pH在贮藏21 d时超过6.0,TVB-N在贮藏18 d时超过25 mg/100 g,根据理化指标结果显示可知真空包装冷却牛肉贮藏期为12 d;贮藏初期主要存在苍白杆菌、巨球菌、Boseavestrisii;贮藏末期主要含有成团泛菌、乳酸杆菌、热死环丝菌、慢生根瘤菌属、广布肉杆菌、美洲爱文氏菌、拉恩氏菌、肠杆菌。

PCR-DGGE,菌相,理化指标,真空包装,冷却牛肉,贮藏时间

牛肉含有优质蛋白质、维生素B和矿物质如锌,硒,磷和铁,能提高机体抗病能力。纵观各类食用肉中消费量中,牛肉消费量排名第三仅次于猪肉和家禽肉,且中国为牛肉消费大国,据统计新疆2003年牛肉产量为37.8万吨同比增长4.4%[1-3]。

研究表明,牛肉在贮藏过程中其质量、安全、营养状况在很大程度上受到内因以及外因的制约,内因如牛肉中存在的酶、牛肉的纤维结构,外因如前处理、包装方式、贮藏温度等。牛肉在贮藏过程中理化性质以及微生物菌群在不同时期会发生不同变化,而这些变化也暗示着肉的品质变化,预示着牛肉食用的安全期,因此,研究牛肉在贮藏过程中的理化指标与微生物指标非常重要[4-5]。

本实验将利用 pH、TVB-N来评价牛肉贮藏过程中理化指标变化,细菌总数、微生物种类来研究贮藏过程的微生物变化。

然而,自然界只有1%左右的细菌能够用传统的培养的方法鉴别,具有费时、费力等局限性;16S rDNA和变性梯度凝胶电泳是一种基于DNA的指纹图谱技术,该技术理论上,在合适的温度与梯度条件下能够将具有一个碱基差异的DNA在聚丙烯酰胺胶上分开,简化了细菌的鉴定,为研究贮藏过程中的菌相变化提供了便捷方法[6-7]。目前将DGGE技术应用于研究鲜肉牛变质过程菌相变化已有研究[8]。

因此,本实验主要目的是利用理化指标结合PCR-DGGE技术分析4 ℃下真空包装牛肉的贮藏期及贮藏期内的菌相变化,为客观评价喀尔万公司出厂牛肉的贮藏期以及哪些微生物导致牛肉品质变化提供理论基础,也为进一步研究保鲜剂的选择及使用提供一定科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

牛肉喀尔万食品科技有限公司;PCA培养基;琼脂糖Biowest;细菌基因组DNA提取试剂盒TIANGEN;聚丙烯酰胺回收试剂盒康为世纪生物科技有限公司;溶菌酶、尿素、过硫酸胺Solarbio;PCR相关试剂、DGGE相关试剂均为分析纯;所用引物均由上海生工合成。

D-37520高速冷冻离心机德国LED热电子公司;PCR仪美国Barloworld Scientific有限公司;Bio-RadDcode apparatus DGGE电泳仪、GelDoc 2000system凝胶成像仪美国Bio-Rad公司;DYY-8C水平电泳仪北京市六一仪器厂;SW-CF-1F超净工作台、海尔控温冰箱、ZXRD-7-80摇床上海智诚有限公司;DNP-9272电热恒温培养箱、LDZX-40Ⅱ压力灭菌锅上海申安医疗器械厂;DZ-400/2C真空包装机上海青浦食品包装机械厂;HI8424NEW pH计上海加惠仪器仪表有限公司；半微量凯氏定氮仪北京市通润源机电技术有限责任公司。

1.2实验方法

1.2.1样品处理牛肉后腿肉为当日清晨屠宰2 h内的肉,无菌操作条件下剔除多余脂肪,分成100 g左右的肉块,真空包装后贮藏于4 ℃备用。

1.2.2pH测定分别于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d取肉样10 g无菌剪刀剪碎,放入装有90 mL蒸馏水的锥形瓶中,混匀振荡30 min,过滤后测其pH。重复三次,取平均值[9]。参考标准:一级鲜度pH5.4～5.6;二级鲜度 pH5.7～5.9;变质肉pH≥6.0[4]。

1.2.3挥发性盐基氮(TVB-N)测定采用GB/T 5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中的半微量凯氏定氮法,分别于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d测定牛肉中的总挥发性盐基氮。参考标准:一级鲜肉≤15 mg/100 g,二级鲜肉≤20 mg/100 g,变质肉≥20 mg/100 g。

1.2.4细菌总数的测定分别于0、3、6、9、12、15、18、21和24 d无菌条件下取25 g肉样(两个平行),无菌剪刀剪碎,加入225 mL灭菌生理盐水112 r/min摇床振摇30 min。取1 mL上清液进行10倍梯度稀释,选择合适的稀释梯度,每个稀释度2个重复,采用PCA培养基于37 ℃培养48 h[10]。培养结束后计数,结果以lg cfu/g表示。指标的评价标准为:参考标准为:一级鲜度<4.0 lg cfu/g,二级鲜度 4.0～6.0 lg cfu/g,变质肉>6.0 lg cfu/g。

1.2.5细菌总DNA提取根据Vitor[11]等方法略有修改。肉样(无菌操作取10 g样品,无菌剪刀剪碎,放入90 mL灭菌生理盐水中)112 r/min摇床振摇30 min,静置5 min,取上清液4 ℃,2000×g离心5 min,取上清液于4 ℃,10000×g离心15 min,取沉淀于1.5 mL离心管中参照DNA提取试剂盒说明提取细菌总DNA。所提取的DNA溶于TE缓冲液中,于-20 ℃贮藏备用。

1.2.6PCR扩增上游引物为带GC夹子的U968,下游引物为L1401。对细菌的16S rRNA的V6～V8区段进行PCR扩增,条带片段约为450 bp。

上游引物GC(U968为5′-CGC CCG GGG CGC GCCCCG GGC GGG GCGGGG GCA CGG GGG GAA CGCGAA GAA CCTTAC-3′;下游引物L1401为5′-CGG TGT GTACAA GACCC-3′。

PCR反应体系为25 μL:DNA模板1 μL,GC-U968和L1401各1 μL,PCR Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 mL。

PCR反应程序:94 ℃预变性2 min,35个循环(94 ℃、30 s,60 ℃、30 s,72 ℃、30 min),最终72 ℃延伸5 min。

PCR产物经1.0%琼脂糖电泳检测后于-20 ℃贮藏备用。

1.2.7变性梯度凝胶电泳(DGGE)参照Wang[12]等方法稍作改动,对细菌16S rRNA基因V6～V8的扩增产物分别进行DGGE分析。采用Biorad Dcode apparatus电泳仪,聚丙烯酰胺胶浓度为8%(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺37.5∶1),变性梯度为38%～58%(100%变性剂含有7 mol/L尿素和40%甲酰胺),在0.5×TAE缓冲液中,60 ℃恒温条件下,200 V电压下电泳10 min,85 V电压下电泳16 h。

电泳结束后,将DGGE胶片用含0.5 mg/L溴化乙啶(Ethidium bromide,EB)染色20 min。回收染液,之后将DGGE胶片用ddH2O漂洗三次,每次5 min。

1.2.8DNA回收与纯化将EB染色的DGGE胶片放置于紫外灯下用无菌手术刀切下不同位置的条带,分别放入1.5 mL的灭菌离心管中,用聚丙烯酰胺回收试剂盒回收胶条,备用。

取3 μL回收的DNA为模板进行16S rRNAV6-V8区域扩增,引物为U968(5′-AAC GCG AAG AAC CTTAC-3′),L1401(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′),PCR扩增程序同1.2.6。产物经1.0%琼脂糖检验后送往北京华大基因测序部测序。登录NCBI,将所得序列与数据库中的已知序列进行相似性比对。

1.3数据处理

实验数据采用BioEdit、Quantity one 4.6.2、Origin 8.6进行处理。

2　结果与分析

2.1pH

由图1可知,贮藏0 d的牛肉pH为5.98,随着贮藏时间的延长pH先下降后上升。pH先下降是因为糖原酵解产生乳酸,三磷酸腺苷分解产生磷酸,乳酸和磷酸逐渐积累,从而使肉的pH下降。随着牛肉成熟期的延长,肉中的蛋白质在细菌、酶作用下被分解为氨和胺类化合物等碱性物质而使pH升高,从图1中也可知,从第15 d牛肉的pH迅速升高。

图1　真空包装冷却牛肉贮藏过程中pH变化Fig.1　Change of pH value in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.2挥发性盐基氮

从图2可见,冷却牛肉中挥发性盐基氮含量随贮藏时间的增加而增加,这是由于氨及胺类物质的产生。TVB-N在第12 d时迅速升高,在15 d时达到23.46 mg/100 g。结合图1、图2可以看出,在贮藏15 d内pH随着TVB-N含量的增加而降低,15 d后pH逐渐增加。以pH为评判标准的真空包装冷却牛肉在21 d才超出6.0,但以TVB-N为评判标准的真空包装冷却牛肉却在15 d时已经超过25 mg/100 g。

图2　真空包装冷却牛肉贮藏过程中挥发性盐基氮变化Fig.2　The change of TVB-N in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.3菌落总数

从图3可以看出,随着贮藏时间的延长,菌落总数呈不断增长的趋势。由于环境的改变,微生物需要适应新的环境即迟滞期,而使得前6 d微生物数量变化不大,从第9 d开始进入对数期,第12 d时有明显的增长。在12 d菌落数已经超过6.0 lg cfu/g。从pH、TVB-N、菌落总数结果可以看出,以不同指标来衡量真空包装冷却牛肉的贮藏期存在显著差异,因此需结合pH、TVB-N值及菌落总数来综合判断肉的新鲜度。

图3　真空包装冷却牛肉贮藏过程中菌落计数Fig.3　Counts of total colonies in vacuum-packaged chilled beef during storage

2.4PCR-DGGE图谱分析

由图4可知,贮藏初期条带也相对较多,表明牛肉样品中初始微生物种类相对较多,随着贮藏时间的延长,一部分条带变弱或消失,一部分条带由弱变强,还出现了一些新条带,表明在贮藏过程菌相组成发生了变化。对图4中标记的条带1～18割胶、扩增、测序并在NCBI基因库中进行相似性比较,结果如表1所示。由表1可知未知序列与已知序列相似性较高。

图4　真空包装冷却牛肉16S rRNA基因V6～V8区DGGE图谱Fig.4　DGGE profile of PCR products for the V6～V8 region of 16S rRNA gene extractedfrom vacuum-packaged chilled beef

结合表1可知贮藏初期真空包装冷却牛肉中主要存在苍白杆菌(条带5)、巨球菌(条带10)、Boseavestrisii(条带14),还有一些测序失败条带,图中未标注,表明贮藏初期牛肉中的细菌种类相对较多。

随着贮藏时间的推移,哈夫尼(条带1)、柠檬酸杆菌(条带3)、苍白杆菌(条带5)、颗粒链杆菌(条带8)、胖杆菌(条带7)、拉恩氏菌(条带16)、不动杆菌(条带18)在贮藏过程中间歇性出现或消失。

表1　DGGE条带分离的主要细菌16S rRNA基因序列相似性比较

至贮藏后期主要优势菌为成团泛菌(条带2)、克雷伯氏菌(条带4)、乳酸杆菌(条带6)、热死环丝菌(条带9)、慢生根瘤菌属(条带12)、广布肉杆菌(条带13)、美洲爱文氏菌(条带15)、肠杆菌(条带17)。说明在贮藏过程中微生物的种类发生了变化,而这些变化可能与贮藏过程肉的酸碱度变化、肉本身所含有的营养物质(如蛋白质、维生素等)、肉的水分活度、真空包装内的气体成分变化、肉中的酶有关。

3　讨论

本研究利用理化指标及菌落总数结合PCR-DGGE技术来探讨真空包装冷却牛肉的贮藏期以及在贮藏期内的微生物变化。结果表明,真空包装冷却牛肉的贮藏期为12 d左右,贮藏末期主要有成团泛菌、拉恩氏菌、乳酸杆菌、热死环丝菌、Bradyrhizobiaceae、广布肉杆菌、美洲爱文氏菌、肠杆菌。根据Barakat[13]等研究发现真空包装的畜禽肉在贮藏末期主要存在广布肉杆菌、居鱼肉杆菌、格氏乳球菌、乳酸乳球菌、粪肠球菌。Yuemei[5]等研究发现真空包装鲤鱼贮藏末期主要存在肉杆菌、气单胞、爱文氏菌、乳酸菌、假单胞且贮藏期为12 d。Vasileios[14]表明包装冷却食品22 ℃条件下贮藏期为5 d且贮藏末期主要存在Leuconostocgasicomitatum、Leuconostocgelidum、Lactococcuspiscium。Fan Zhao[15]研究表明真空包装冷却猪肉贮藏期为21 d,贮藏第7 d为微生物多样性的关键时间点,主要有微球菌、黄杆菌、肠杆菌、乳酸菌、肉杆菌。贮藏中细菌种类不同这可能是由于取样的环境、初始微生物种类以及样品不同等引起的菌相不完全相同。

Gill[16]研究表明真空包装的条件下为乳酸菌、肠杆菌、腐败希瓦氏菌、热死环丝菌的生长提供了有利条件。真空包装冷却牛肉贮藏过程中,菌落总数不断增加根据评判标准在贮藏12 d已经超过6 lg cfu/g。pH在5.4～5.7的牛肉能够保持良好的冷却肉品质,虽然高pH更适合于加工,但好品质的牛肉比生产价值更重要。本实验中pH在贮藏初期处较高后下降再上升,这是由于贮藏过程糖酵解产生酸,酸浓度与pH成正比与肉品质成反比[17]。大多数腐败卫生物的最低生长pH为5.5,有的也能在pH<5的条件下生长,如Clostridiumfrigidicarnis[18]。挥发性盐基氮在贮藏过程不断上升,这是因为蛋白质在微生物的作用下产生氨及胺类物质。当糖原酵解、三磷酸腺苷分解产生乳酸、磷酸,酸性环境为乳酸菌的生长提供了有利条件,乳酸菌利用肉中的营养物质产生代谢产物乳酸使肉中的pH进一步下降,但真空包装肉中的糖原及三磷酸腺苷是有限的,随着蛋白质的降解产生碱性物质,碱与酸发生酸碱结合从而使pH上升,这也为一些腐败微菌的生长提供了条件[19]。热死环丝菌是一种兼性厌氧菌能够在高盐(10%)、低pH(5.5～6.5)、4 ℃低温条件下生长,在真空包装下也能利用有限氧气代谢,产生不良气味[16]。因此,热死环丝菌也是肉类腐败的一个指标[20]。Jones等[21]发现清酒乳杆菌存在于贮藏12周的真空包装牛肉中,因此乳杆菌也是肉类腐败的指标。

4　结论

菌落总数在第12 d达到6.4 lg cfu/g,第21 d的pH为6.18,TVB-N值在15 d已经超过了20 mg/100 g,因此,中和微生物指标与理化指标可知真空包装冷却牛肉贮藏期为12 d左右;真空包装牛肉贮藏初期微生物种类较少,有苍白杆菌、Boseavestrisii、巨球菌;随着贮藏时间延长肉的理化指标降低在贮藏末期主要含有成团泛菌、乳酸杆菌、热死环丝菌、Bradyrhizobiaceae、广布肉杆菌、美洲爱文氏菌、拉恩氏菌、肠杆菌;真空包装冷却牛肉贮藏过程中,肉中酸碱度变化为某些细菌的生提供了有利条件,如热死环丝菌、乳酸菌。

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Physicochemical and microflora change of vacuum-packaged beef during chilled storage

LI Juan1,LU Shi-ling1,WANG Qing-ling1,*,SUN Dan-dan1,HOU Fu-qin2

(1.Food College of Shihezi Uninersity,Shihezi 832000,China; 2.Xinjiang Calvin Wan Food Science and Technology Co.,Ltd.,Shihezi 832000,China)

The microfloral change was explored by PCR-denaturing gradient gel eletrophoresis(PCR-DGGE)and pH,TVB-N,the total number of colonies were measured every three days in vacuum-packaged beef at 4 ℃. Results showed that,vacuum-packaged beef storaged at 4 ℃,the total number of colonies during the twelfth days of storage had more than 6.0 lg cfu/g,pH during the twenty-first days of storage more than 6.0,TVB-N during the eighteenth days of storage more than 25 mg/100 g,according to physical and chemical indicators showed that vacuum packaged chilled beef storage period for 12 days.Ochrobactrumsp.,Boseavestrisii,Macrococcuscaseolyticuspredominated in early stage during chilled storage,whereas in the end of storage periodPantoeaagglomerans,Brochothrixthermosphacta,Carnobacteriumdivergens,Bradyrhizobiaceae,Lactobacillussp.,EwingellaAmericana,Rahnellaaquatilis,Enterobacteriaceaepredominated.

PCR-DGGE;microfloral;physical and chemical indexes;vacuum package;chilled beef;storage time

2015-11-09

李娟(1989-)，女，在读硕士研究生，研究方向：畜产品加工与质量安全，E-mail:948733770@qq.com。

王庆玲(1981- )，女, 博士, 副教授，研究方向：食品安全与检测，E-mail:Qingling1100@163.com。

宰后牛肉品质控制技术及应用研究(2014GY04)。

TS205.7

A

1002-0306(2016)10-0324-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.058