刘珊春,赵　欣,骞　宇,李　键,陈炼红,陈　娟,索化夷,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715; 2.西南大学 重庆市特色食品工程技术研究中心,重庆 400715; 3.重庆第二师范学院生物与化学工程系,重庆 400067; 4.西南民族大学青藏高原研究院,四川成都 610041; 5.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)



西藏羊八井地区牦牛酸乳中乳酸菌菌种鉴定

刘珊春1,2,赵欣3,骞宇3,李键4,5,陈炼红4,5,陈娟5,索化夷1,2,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715; 2.西南大学 重庆市特色食品工程技术研究中心,重庆 400715; 3.重庆第二师范学院生物与化学工程系,重庆 400067; 4.西南民族大学青藏高原研究院,四川成都 610041; 5.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

26株分离自西藏羊八井地区传统发酵牦牛酸乳的菌株,经形态学、分子生物学鉴定,其中18株为肠球菌属(Enterococcus)、6株为乳杆菌属(Lactobacillus)、2株为明串珠菌属(Leuconostoc)。构建系统发育进化树分析乳酸菌的遗传多样性,并与其它地区牦牛酸乳中分离到的乳酸菌进行比较,发现西藏羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中乳酸菌多样性丰富,其优势乳酸菌株为肠球菌属(Enterococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)。

乳酸菌,牦牛酸乳,菌种鉴定,16S rDNA

牦牛主要分布于青藏高原及其毗邻高山地区,西藏地区共有牦牛390万头,占全世界牦牛总数的30%[1-2]。牦牛为藏区牧民提供乳、肉、皮毛等畜产品,是当地重要的经济来源[3]。与普通牛乳相比,牦牛乳富含蛋白质、必需氨基酸、脂肪、乳糖和矿物质等[4],深受当地牧民和游客喜爱。传统发酵牦牛酸乳是一种以新鲜牦牛乳为原料,经多种乳酸菌和酵母菌等微生物共同发酵而成的一种低酒精含量风味乳品,其中有许多具有优良特性的乳酸菌,是一个复杂的微生物体系。冶成君[5]研究发现,青海玉树牧区凝固型牦牛酸乳中有德氏乳杆菌、乳球菌、芽孢杆菌、肠球菌等多种乳酸菌;蒋厚阳[6]应用PCR-DGGE法分析西藏传统发酵奶酪(奶渣)中乳酸菌,发现了副干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌等12种乳酸菌,其中德氏乳杆菌为优势菌种。

乳酸菌的鉴定方法主要分为表型特征鉴定法和基因型鉴定法。利用16S rDNA序列分析、变性梯度凝胶电泳标记技术(DGGE)等分子生物学技术对乳酸菌进行分类鉴定的优势日益明显。夏雪娟等[7]采用属特异性PCR、16S rDNA序列同源性分析、种特异性PCR与NEBcutter分析相结合的方法,对西藏地区传统乳制品中乳酸菌进行鉴定。董晓婉[8]等采用传统的生理生化实验和16S rDNA基因序列分析相结合的方法,对新疆蒙古族和哈萨克族酸奶中乳酸菌进行鉴定。Yu[9]等研究发现PCR-RFLP分析和16S rDNA相结合的方法能快速、简便、有效的鉴定乳酸菌。

本实验以实验室保存的分离纯化自羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中的26株菌为研究对象,采用16S rDNA基因序列分析进行种属鉴定,构建系统发育进化树确定乳酸种属,并与其他地区牦牛酸乳中分离到的乳酸菌进行比较,为牦牛酸乳中乳酸菌资源的开发利用提供基础信息。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

26株菌株来源于本实验室保存的,从西藏羊八井地区牧民家庭的自然发酵牦牛酸乳中分离纯化的菌种;MRS肉汤青岛高科园海博生物技术公司;碳酸钙(分析纯)成都市科龙化工试剂厂;通用基因组DNA提取试剂盒、RNase A、蛋白酶K、DNA Lodaing Buffer、TAE缓冲溶液、琼脂糖、Pfu DNA Polymerase、Pfu Buffer(含Mg2+)、dNTPs Mixture北京索莱宝科技有限公司;λDNA/HindⅢ、100 bp DNA Ladder天根生化(北京)科技有限公司;GelRed TM核酸染料Biotium中国总代理;引物1495R、27F上海生工生物工程公司。

Elix10纯水系统、Biocel超纯水系统美国Millipore公司;OLYMPUS-BX43生物显微镜日本奥林巴斯公司;S1000 Thermal Cycler梯度PCR仪、Mini-Sub Cell GT Cel小型水平电泳槽美国Bio-Rad公司;Gene Genius凝胶成像系统英国SynGene公司。

1.2实验方法

1.2.1菌株的活化镜检本实验样本原保存于含碳酸钙的MRS固体培养基中,无菌条件下,从培养基表面挑取有溶钙圈的单菌落接种于MRS液体培养基中,置于摇床中30 ℃振荡培养24～48 h。将培养后的MRS液体培养基振荡摇匀,划线接种于MRS固体培养基中,置于恒温培养箱中30 ℃培养48～72 h,观察并记录菌落形态。重复以上步骤连续纯化两代,挑取单菌落于载玻片上,进行革兰氏染色[10]、镜检。

1.2.2菌株基因组DNA提取确定无杂菌后,再次挑取单菌落于MRS液体培养基中,置于摇床中30 ℃振荡培养24 h,取培养液按照细菌基因组DNA提取试剂盒的操作说明对菌株进行DNA提取,并储存于-20 ℃备用。

1.2.3PCR扩增

1.2.3.1PCR引物PCR扩增对象为菌株的16S rDNA基因。PCR所用引物为生工生物技术公司合成的16S rDNA基因通用引物27F及1495R。

上游引物27F序列:5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′

下游引物1495R序列:5′-CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA-3′

1.2.3.2PCR扩增体系(25 μL反应体系)模板DNA1 μL,上游引物27F 0.5 μL,下游引物1495R 0.5 μL,10×Taq plus Buffer(含Mg2+)2.5 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)2.0 μL,Taq plus(2.5 μ/μL)1.0 μL,ddH2O 17.5 μL。

1.2.3.3 PCR扩增条件94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1.5 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共30个循环;72 ℃延伸10 min。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物用1.4%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,电压80 V,电泳时间40 min,经GelRed核酸染料染色后,在凝胶成像系统中观察拍照。

1.2.516S rDNA PCR扩增产物测序、鉴定由北京华大基因公司对26株菌16S rDNA进行测序。用DNAStar 7.1中的SeqMan软件进行序列拼接和校准,然后在Gene Bank数据库中进行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)比对,利用其中的检索库进行序列的同源性分析并确定其种属,根据样本编号保存检索结果,并按照种属关系对样本进行分类。

1.2.6系统发育进化树的构建调取GenBank数据库中收录的16株乳酸菌的相同区段基因序列,利用ClustalX1.83软件将测序菌株与标准菌株的16S rDNA基因序列进行多序列匹配比对,使用MEGA5.05软件采用邻接法(Neighbor-Joining)[11]计算,构建乳酸菌的系统进化树,采用自举分析进行置信度检测,自举数据集为1000次。

2　结果与分析

2.1菌株形态结构

如图1、图2所示,菌株划线接种于MRS固体培养基培养后,有单菌落出现,菌落形态呈圆形,颜色呈乳白色,表面光滑,边缘整齐,不透明。

图1　Y13菌落形态Fig.1　Colony morphology of Y13

图2　Y4菌落形态Fig.2　Colony morphology of Y4

如图3、图4所示,显微镜下细胞染色为蓝紫色,为革兰氏阳性菌;形态为球形、椭圆、短杆状、长杆状等,细胞形态符合乳酸菌特征。

图3　Y13革兰氏染色结果(1000×)Fig.3　Gram staining results of Y13(1000×)

图4　Y4革兰氏染色结果(1000×)Fig.4　Gram staining results of Y4(1000×)

2.2乳酸菌16S rDNA序列PCR扩增结果

扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5所示,阴性对照无条带,说明扩增未出现污染;1～26泳道均得到长度约1500 bp的特异性扩增片段,符合预期扩增片段长度。

图5　乳酸菌PCR扩增产物16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.5　Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA-PCR products from lactobacillus注:M.100 bp DNA Ladder;0.空白组;1～26.编号为1～26的菌株。

2.3PCR扩增产物测序与GeneBank鉴定种属

委托北京华大基因公司对扩增成功菌株的PCR产物进行双向测序,获得序列经SeqMan软件拼接后,通过BLAST在GeneBank核酸序列数据库中进行同源性比对,有效(同源率98%以上)结果如表1所示。

表1　16S rDNA序列鉴定26株菌结果

表2　26株乳酸菌的16S rDNA序列鉴定结果

结果表明,26株菌均鉴定成功,其中有2株乳酸菌与GeneBank数据库中已知乳酸菌具有高达100%的同源性;22株有99%的同源性;2株有98%的同源性。总结26株乳酸菌的分子生物学鉴定结果,如表2所示。

这26株乳酸菌经鉴定属于3个属,5个种。结果表明,西藏羊八井地区牦牛酸乳中球菌和杆菌分别以肠球菌属(69.23%)和乳杆菌属(23.07%)为优势菌属。

2.4系统发育分析结果

由该进化树可知,从总体上可将这26株乳酸菌分为3个大群。即菌株Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y9、Y10、Y11、Y12、Y14、Y15、Y18、Y19、Y20、Y21、Y23、Y24、Y25和耐久肠球菌为第一群;菌株Y6、Y7、Y8、Y13、Y16、Y17、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌为第二群;菌株Y22、Y26、乳明串珠菌、肠系膜明串珠菌为第三群。同时,系统发育进化树也表明肠球菌属和明串珠菌属之间的亲缘关系较近,而与乳杆菌属之间的亲缘关系较远。另外,第3、4、16、21株在各自进化枝内与其他菌株距离较远,表明在种内也有较高的遗传多样性。综合看来,西藏羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中含有丰富的乳酸菌菌种,反映出乳酸菌的生物多样性。其优势菌种为耐久肠球菌和干酪乳杆菌。这与其他研究者对西藏地区牦牛酸乳中乳酸菌的研究结果不同。例如,Yu等[9]采用16S rRNA-RFLP技术对西藏地区牦牛酸乳的乳酸菌多样性进行了研究,发现发酵乳杆菌和瑞士乳杆菌是这一地区牦牛酸乳中的主要乳酸菌。杨俊俊[12]研究西藏牦牛奶渣中的乳酸菌,指出耐久肠球菌、类干酪乳杆菌干酪亚种、屎肠球菌和植物乳杆菌为主要乳酸菌;陈芝兰等[13]对西藏地区传统发酵乳中乳酸菌进行分离、鉴定,发现其中的优势菌株为干酪乳杆菌、植物乳杆菌和类布氏乳杆菌。由此可见,西藏不同地区传统发酵乳制品中乳酸菌菌种含量丰富,不同地区、甚至相同地区不同作坊的发酵乳、菌种也会有较大差异,发映出乳酸菌的生物多样性。

图6　26株乳酸菌系统发育进化树Fig.6　Phylogenetic tree of the 26 lactobacillus strains

雷霞[14]和旭日花[15]对内蒙古不同地区的酸牛奶为研究对象进行了乳酸菌的分离鉴定,均分离得到了干酪乳杆菌、耐久肠球菌,同时,雷霞还分离到了乳明串珠菌,说明干酪乳杆菌、耐久肠球菌、乳明串珠菌是酸乳中常见的乳酸菌。Ao[16]等对四川红原地区牦牛酸乳的研究发现,耐久肠球菌、发酵乳杆菌和副干酪乳杆菌是其中的优势乳酸菌。杨俊俊[12]发现耐久肠球菌是西藏牦牛奶渣中的主要乳酸菌。不同地区的传统发酵乳制品中都发现了耐久肠球菌,有些甚至发现耐久肠球菌为优势乳酸菌。乳制品中出现肠球菌大多数是由于生产过程中受到粪便的污染,但许多传统发酵乳制品中都分离出了耐久肠球菌和屎肠球菌,且有研究发现,肠球菌能促进干酪成熟,改善奶酪的风味和口感[17],耐久肠球菌可以改善传统发酵酸乳的外观和质地[16]。

3　结论

对西藏羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中26株菌进行鉴定,发现有2株乳酸菌与GeneBank数据库中已知乳酸菌具有高达100%的同源性;22株有99%的同源性;2株有98%的同源性。采用16S rDNA序列分析对传统发酵牦牛酸乳中的乳酸菌进行分子生物学鉴定,准确度高、结果可靠。经鉴定,实验中26株乳酸菌包括肠球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属等3个属,耐久肠球菌(69.23%)、干酪乳杆菌(15.38%)、副干酪乳杆菌(7.69%)、肠系膜明串珠菌(3.85%)、乳明串珠菌(3.85%)等5个种。这说明西藏羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中乳酸菌资源种类丰富,其中耐久肠球菌和干酪乳杆菌为主要的乳酸菌。西藏羊八井地区传统发酵牦牛酸乳中分离的乳酸菌种与其他地区奶制品中分离的乳酸菌存在明显差异,推测造成这些差异的原因主要包括所用原料、制作工艺、发酵条件等方面。实验中分离到的乳杆菌可以进行后续的益生性能和发酵优良乳酸菌的筛选。

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Identification of lactobacillus isolated from fermented yak milk in Tibetan Yangbajing area

LIU Shan-chun1,2,ZHAO Xin3,QIAN Yu3,LI Jian4,5,CHEN Lian-hong4,5,CHEN Juan5,SUO Hua-yi1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China; 2.Chongqing Engineering Research Center of Regional Food,Chongqing 400715,China; 3.Department of Biological and Chemical Engineering,Chongqing University of Education,Chongqing 400067,China; 4.Institute of Qinghai-Tibetan Plateau,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China; 5.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China)

The 26 strains isolated from traditional fermented yak milk in Yangbajing area were identified by morphological and molecular identification,including 18Enterococcusstrains,6Lactobacillusstrains,2Leuconostocstrains.Construct phylogenetic tree to analysis the genetic diversity oflactobacillusand compare with thelactobacillusthat were separated from other places,finding that they have rich biodiversity,EnterococcusandLactobacilluswere the most common culturable species.

Lactobacillus;yak yogurt;identification;16S rDNA

2015-11-09

刘珊春(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：发酵微生物，E-mail：liushanchun516@163.com。

索化夷(1978-)，男，博士，副教授，研究方向：发酵微生物，E-mail：birget@swu.edu.cn。

国家公益性行业(农业)科研专项(201303085)；重庆市社会民生科技创新专项(cstc2015shmszx80021)；重庆市特色食品工程技术研究中心能力提升项目(cstc2014pt-gc8001)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0208-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.034