赵秀伶　马红梅　马　唯　单志娟　洛　丽

(1.首都医科大学附属北京潞河医院产科， 北京 101100； 2.首都医科大学附属北京潞河医院检验科， 北京 101100；3.首都医科大学附属北京潞河医院病理科， 北京 101100)



· 临床研究 ·

NK细胞与早发型重度子痫前期疾病进展的相关性研究

赵秀伶1*马红梅1马唯1单志娟2洛丽3

(1.首都医科大学附属北京潞河医院产科， 北京 101100； 2.首都医科大学附属北京潞河医院检验科， 北京 101100；3.首都医科大学附属北京潞河医院病理科， 北京 101100)

目的 探讨自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)与早发型重度子痫前期发生、发展的相关关系。方法选取2012年1月至2014年12月在北京潞河医院定期孕检的重度子痫前期患者44例(早发型重度子痫前期20例,晚发型重度子痫前期24例)为研究对象。选取同时期正常无合并症的患者20例为对照组。采集母亲外周血2 mL，胎儿脐带血2 mL及蜕膜组织。采用流式细胞学方法检测外周血和脐带血中的CD3-CD16-CD56+的百分率；蜕膜组织应用免疫组织化学方法，计算CD3-CD16-CD56+的数量取均值，应用计算机图像分析法读取CD56+细胞平均灰度值。结果重度子痫前期组外周血、脐血、蜕膜组织中的NK细胞数量高于对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)；早发型重度子痫前期组脐血、蜕膜组织中NK细胞数量高于晚发型重度子痫前期组，差异有统计学意义(P<0.05)。重度子痫前期外周血、蜕膜组织中的NK细胞数量与病程进展呈负相关(r=-0.397，P=0.040；r=-0.391，P=0.044)，与血压升高幅度呈正相关(r=-0.597，P=0.001；r=-0.416，P=0.031)。蜕膜组织中的NK细胞数量与确诊重度子痫前期的孕周呈负相关(r=-0.594，P=0.003)。结论重度子痫前期患者外周血、脐血、蜕膜中NK细胞数量增加，早发型重度子痫前期增加更为显著。外周血、蜕膜中NK细胞数量与早发型重度子痫前期的发生、发展相关。

早发型重度子痫前期； 自然杀伤细胞； 蜕膜

妊娠期高血压疾病是严重的妊娠期特发性疾病之一，严重威胁母儿生命。我国发生率9.4%～10.4%，国外7%～12%，其中早发型重度子痫前期(孕34周前)约占妊娠期高血压疾病的0.9%[1]。妊娠期高血压疾病对母婴健康的危害以早发型重度子痫前期最为明显。近年来对于早发型重度子痫前期的防治，是产科的热点问题之一。自然杀伤细胞(natural killer cell, NK)细胞可诱发子痫前期。但是NK细胞与子痫前期的病情严重程度，子痫前期的起始时间关系尚不明确。本研究通过早发型重度子痫前期NK细胞表达的水平，探讨NK细胞与早发型重度子痫前期发生、发展的相关关系，为NK细胞与子痫前期发病机制的研究提供实验数据。

1　研究对象与方法

1.1研究对象

选取2012年1月至2014年12月在首都医科大学附属北京潞河医院产科门诊定期孕检的单胎重度子痫前期患者为研究对象，共纳入研究44例(早发型重度子痫前期患者20例，晚发型重度子痫前期患者24例)。按照2∶1比例，选取同时期因臀位、骨盆狭窄等产科因素行剖宫产终止妊娠的患者20例为对照组。所有研究对象均排除合并慢性高血压、糖尿病、宫内感染、术前发热、甲状腺疾病、胎膜早破、自身免疫性疾病、肾炎及经阴道分娩者。

1.2诊断方法

重度子痫前期的诊断按照谢幸等[2]主编的第8版《妇产科学》中妊娠期高血压疾病的分类与临床表现标准；根据发病时间早晚，将孕34周前诊断的重度子痫前期为早发型，孕34周后诊断的重度子痫前期为晚发型[1]。

1.3研究方法

采用前瞻性对照研究。研究对象入组后，确诊重度子痫前期时，立即采集孕妇外周静脉血(2 mL)，对照组入组时采集外周血，给予EDTA-K2抗凝，24 h内经流式细胞仪检测CD3-CD16-CD56+的百分率。剖宫产术中新生儿娩出后立即留取脐带血2 mL、给予EDTA-K2抗凝，24 h内经流式细胞仪检测CD3-CD16-CD56+的百分率。胎盘娩出后30 min内取胎盘母体面绒毛组织5～10块, 约1 cm×1 cm×1 cm的组织, 置入10%(质量分数)多聚甲醛溶液中固定24 h以上, 常规石蜡包埋, 连续切片,厚4 μm。采用免疫组织化学(SP)法, CD3、CD16、CD56单抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，工作浓度1∶100，每实验切片高倍镜下选取3个高倍视野，计数CD3-CD16-CD56+的量取均值。采用计算机图像分析法计算CD56+细胞平均灰度值。所有胎盘送病理，排除宫内感染。

1.4统计学方法

2　结果

2.1重度子痫前期组与对照组患者一般情况的比较

3组患者年龄、孕产次、基础平均动脉压、术前白细胞计数比较差异无统计学意义(均P>0.05)；早发型重度子痫前期组孕期平均动脉压升高幅度高于晚发型重度子痫前期组，差异有统计学意义(P=0.027)；病情进展速度即：血压升高到确诊重度子痫前期(preeclampsia PE)的时间比较，差异有统计学意义(P=0.047)；2组临床表现(如以高血压为主要表现/其他脏器损伤为主要表现所占比例、尿蛋白定量)比较，差异无统计学意义(表1)。

2.2NK细胞比较

早发型重度子痫前期组、晚发型重度子痫前期组的外周血、脐血、蜕膜组织中CD3-CD16-CD56+细胞数量明显高于对照组，差异有统计学意义(F=6.067，P=0.000；F=7.400，P=0.002；F=8.986，P=0.000)。两两比较，早发型重度子痫前期组外周血、脐血、蜕膜组织中CD3-CD16-CD56+细胞数量高于对照组，差异均有统计学意义。早发型重度子痫前期组脐血及蜕膜组织中CD3-CD16-CD56+细胞数量高于晚发型重度子痫前期组，差异均有统计学意义(表2)。

应用计算机图像分析法计算CD56+平均灰度值，3组CD56+平均灰度值比较，差异有统计学意义(P<0.05)；两两比较，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)，详见表3。

2.3NK细胞与子痫前期相关性

外周血、蜕膜、脐血中NK细胞与重度子痫前期的病程进展速度及血压升高幅度相关性分析：外周血和蜕膜组织中NK细胞数量与病程进展呈负相关(r=-0.397、r=-0.391)，与平均动脉压升高幅度正相关(r=0.597、r=0.461)；蜕膜组织NK细胞数量与重度子痫前期确诊孕周呈负相关，相关系数：r=-0.594 ；脐血中NK细胞与重度子痫前期的病程进展、平均动脉压升高程度、确诊孕周无相关(表4)。

3　讨论

妊娠子宫最主要的淋巴细胞是NK细胞源性的大颗粒细胞，占淋巴细胞的70%～80%。胎盘蜕膜表面局部浸润的NK细胞可能来自于母体外周血NK细胞和胎儿肝脏趋化而来[3]。蜕膜中的NK细胞不同于外周血中的细胞，高表达CD56，主要表型为CD56+CD16-CD3-[4]。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell Ig-like receptor-2DL4, KIR2DL4)通过识别人类白细胞抗原-G (human leukocyte antigen-G, HLA-G)，向NK细胞传递抑制性信号，抑制NK细胞活性，保护滋养层细胞免受NK细胞杀伤作用，使母体对胚胎抗原免疫耐受并且控制滋养细胞的迁徙，调节淋巴细胞释放细胞因子[5-7]发挥作用。

表1　3组一般情况比较

△1 mmHg=0.133 kPa.

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vslate onset preeclampsia group; NK: natural killer cell.

表3　胎盘蜕膜CD56+细胞平均灰度值比较

表4　重度子痫前期疾病进展与NK细胞的相关性

NK: natural killer cell; PE:preeclampsia.

蜕膜中的NK细胞能分泌大量的细胞因子，如：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，干扰素、生长刺激因子-1、肿瘤坏死因子等[3]。干扰素-γ、干扰素-α具有组织滋养叶细胞迁移作用，引起胎盘浅着床、螺旋动脉重铸受阻，诱发病理妊娠[8-9]。马艳娟等[10]发现，子痫前期孕妇HLA-G分子的表达明显减少。李源等[11]的研究提示子痫前期患者胎盘组织KIR2DL4 mRNA表达明显降低。HLA-G与KIR2DL4 mRNA低表达，对NK细胞的抑制作用减弱或消失，NK细胞数量增生，导致子痫前期。本研究中，重度子痫前期组外周血、脐血及蜕膜组织中NK细胞数量明显高于正常对照组，提示NK细胞可能参与了重度子痫前期的发生。

尽管对于HLA在妊娠期高血压疾病发病中的作用也得到证实，但是HLA与重度子痫前期的严重程度以及发病时间的关系报道很少[13]。早发型重度子痫前期与晚发型重度子痫前期发病机制不同，母胎免疫耐受机制的破坏被认为是早发型重度子痫前期发病机制的关键。有学者[12]提出早发型子痫前期病变可能主要通过胎盘病变影响母体双方疾病的发展，而晚发型子痫前期病变则为直接母体反应。本研究发现，早发型子痫前期组(<34周)蜕膜组织中NK细胞数量明显高于晚发型子痫前期组(≥34周)，并且蜕膜组织中的NK细胞数量与确诊子痫前期的时间呈负相关(r=-0.594)。推测蜕膜组织中的NK细胞的异常增生与重度子痫前期发病时间有关。但是NK细胞增生的速度、程度与重度子痫前期发病的关系还有待进一步的研究。

魏军等[14-15]发现重度子痫前期患者血清在NK细胞作用下，血管内皮细胞分泌血管收缩因子——内皮素-1增多，分泌血管舒张因子——前列环素减少。病理学研究[16]也显示，与晚发型子痫前期相比，早发型患者胎盘床面积减少，其胎盘的各级动静脉血管管径明显变细。本研究中，早发型重度子痫前期患者的平均动脉压升高幅度明显高于晚发型重度子痫前期(P=0.027)，且外周血与蜕膜组织中的NK细胞数量与孕期血压升高幅度呈正相关，考虑与NK细胞作用下血管内皮细胞分泌的收缩血管物质增多有关。由于血压明显升高，缩短了从出现临床表现到确诊重度子痫前期的时间。本研究提示外周血及蜕膜组织中NK细胞数量的增加与病程进展呈负相关。提示NK细胞可能对重度子痫前期疾病进展起作用。笔者推测早发型重度子痫前期血压升高时，NK细胞水平可能已经升高，加速了病程进展，因此NK细胞可能与早发型重度子痫前期的发生时间相关。

综上所述，重度子痫前期患者外周血、脐血、蜕膜中NK细胞数量增加，早发型重度子痫前期患者增加更为显著； NK细胞与早发型重度子痫前期的发生发展相关。但是由于本研究样本量小，具有局限性，尚需大样本研究进一步证实。

[1]林其德.重视早发型重度子痫前期的预测和诊治[J].中国实用妇科与产科，2009,25(4):241-242.

[2] 谢幸，苟文丽.妇产科学[M]. 8版.北京：人民卫生出版社，2013：64-71.

[3] 赵丽丽,王俐，曲迅，等.妊娠期子宫NK细胞功能的研究[J].现代免疫学，2005,25(1)：85-88.

[4] 姜妮娜.子痫前期患者子宫蜕膜自然杀伤细胞的表型研究[J].西部医学,2015,27(5):745-747.

[5] Shankarkumar U， Shankarkumar A, Chedda Z，et al.Role of 14-bp deletion/insertion polymorphism in exon 8 of HLA-G gene in recurrent spontaneous abortion patients [J]. J Hum Repord Sci,2011,4(3):143-146.

[6] Rajagopalan S. HLA-G mediated NK cell senescence promotes vascular remodeling: implications for reproduction [J]. Cell Mol Immunol,2014,11(5):460-466.

[7] 范玉芹,李磊,王谢桐.免疫调控在子痫前期早期干预中的作用和评价[J].中国实用妇科与产科杂志,2014,30(10):771-774.

[8] Hu Y, Tan R, MacCalman C D, et al. IFN-γ-mediated extravillous trophoblast outgrowth inhibition in first trimest er explant culture: a role for insulin-like growth factors [ J]. Mol Hum Reprod, 2008， 14(5) : 281-289.

[9]郝莎,李鹏飞,李若天,等.子痫前期动物小鼠模型的NK细胞和细胞因子的变化[J].中国免疫学杂志,2009， 25(8):708-712.

[10]马艳娟,刘陶,王慧,等.HLA-G在子痫前期患者血清及胎盘中的表达及意义[J].实用妇产科杂志，2014,30(6):452-456.

[11] 李源,张为远.杀伤细胞免疫球蛋白样受体在子痫前期胎盘组织中的表达及意义[J].北京医学，2014,36(1):978-979.

[12]张新艳,姚元庆.早发型重度子痫前期的基因遗传学研究[J].中国实用妇科与产科，2009,25(4):243-244.

[13] Ma R Q,Sun M N,Yang Z. Effects of preeclampsia-like symptoms at early gestational stage on feto-placental outcomes in a mouse model [J].Chin Med J, 2010,123(6):707-712.

[14] 魏军,李雪岭,尹盛婷,等.重度子痫前期患者血清作用下NK细胞对血管内皮细胞分泌内皮素-1及前列环素的影响[J].中国现代医学杂志，2011, 21(21):2592-2595.

[15] 魏军,杨志英,杨再霞,等.重度子痫前期患者血清对外周血NK细胞杀伤活性的影响[J].中国医学大学学报,2011,40(2):137-139.

[16] Kadyrov M, Kingdom J C, Huppertz B. Divergent trophoblast invasion and apoptosis in placental bed spiral arteries from pregnancies complicated by maternal anemia and early onset preeclampsia/intrauterine growth restriction [J].Am J Obstet Gynecol，2006,194(2):557-563.

编辑孙超渊

Study about the correlation of NK cell with early onset preeclampsia

Zhao Xiuling1*, Ma Hongmei1, Ma Wei1, Shan Zhijuan2, Luo Li3

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101100,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101100,China; 3.DepartmentofPathology,BeijingLuheHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing101100,China)

ObjectiveTo study the correlation of natural killer cell (NK) to early onset preeclampsia. MethodsThis research adopts the case-control study. 44 preeclampsia patients who were regularly checked up in BeiJing LUHE hospital from Jan 2012 to Dec 2014 entered the research. The group included 20 early onset preeclampsia patients and 24 late onset preeclampsia patients. The control group was normal patients at the same period. Collecting maternal peripheral blood umbilical blood and deciduas. We test percentage of NK cell in peripheral and umbilical blood by Flow cytometry. NK cells in deciduas were tested by immunohistochemistry. ResultsThe courts of NK cells in maternal peripheral, umbilical blood and deciduas of early onset preeclampsia and late onset preeclampsia were all higher than those of the normal (P<0.05). It is significantly different. The counts of the NK cells in umbilical blood and deciduas were significantly higher than those of the late onset preeclampsia patients (P<0.05). The NK cell percentage in maternal peripheral blood in early onset preeclampsia patients were higher than in late onset preeclampsia patients.P<0.05. The courts of NK cells in maternal peripheral and deciduas was with negative correlation with course of preeclampsia.(r=-0.397，P=0.040；r=-0.391,P=0.044). It was positive correlation with the degree of elevation of pressure. (r=-0.597，P=0.001；r=-0.416,P=0.031). The courts of NK cells in deciduas was positive correlation with the time of diagnosis. (r=-0.594，P=0.003). ConclusionThe counts of the NK cell in maternal peripheral blood, umbilical blood and deciduas in preeclampsia patients were significantly higher than those of the control. Early onset severe preeclampsia increased significantly. NK cell in maternal peripheral blood and deciduas probably play a role in early onset preeclampsia.

early onset preeclampsia; Natural killer cell; deciduas

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.04.025]

R 71

2016-03-01)

*Corresponding author， E-mail：lhyyzxl@hotmail.com

网络出版时间：2016-07-2021∶18网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160714.2118.054.html