周　艳，王晓红，王同坤，范得跃，刘俊芳

(河北科技师范学院 河北省板栗工程技术研究中心,河北 秦皇岛,066600)



盐酸提取法和微波提取法提取燕山板栗多糖的最佳工艺及比较

周艳，王晓红，王同坤*，范得跃，刘俊芳

(河北科技师范学院 河北省板栗工程技术研究中心,河北 秦皇岛,066600)

为探明燕山板栗多糖的最佳提取工艺，采用单因素试验和正交试验确定了盐酸提取法和微波提取法提取板栗多糖的最佳条件，并采用苯酚-硫酸法和高效液相色谱法比较了两种提取方法在多糖得率和分子量分布上的差异。结果表明：盐酸提取法提取板栗多糖的最佳工艺为：盐酸浓度为0.72 mol/L，提取时间为40 min，提取温度为70 ℃，提取剂用量为20 mL/g，多糖得率为18.66%±2.54%；微波提取法提取板栗多糖的最佳提取工艺为：提取时间为50 s，微波强度为800 W/g，提取剂用量为30 mL/g，多糖得率为11.87%±0.87%；在最佳条件下盐酸提取法可显著提高板栗多糖得率，且分子量测定结果显示盐酸提取法对板栗多糖的降解作用小。因此，两种提取方法中，盐酸提取法是燕山板栗多糖提取工艺的较优方法。

板栗多糖；提取工艺;盐酸提取法；微波提取法；得率；分子量分布

板栗(CastaneamollissimaBlume)原产于中国，是我国的主要经济树种之一，目前板栗多糖的提取方法主要有热水提取法[1,2]、加压溶剂萃取法[3]、亚临界提取法[4]、超声提取法[5,6]等。盐酸提取法是通过盐酸作用，使植物细胞吸水溶胀导致细胞破裂进而释放游离的多糖；微波提取法是根据微波在传输过程中遇到不同性质的物质时，会在微波的反射、穿透和吸收上产生差异，进而选择性地使细胞内的极性分子的温度升高，细胞内压增大，最终使细胞内的有效成分自动流出的原理进行提取。目前，尚无有关盐酸提取法和微波提取法提取板栗多糖的相关报道。

因此，为比较两种方法对板栗多糖提取率及多糖分子量分布的影响，笔者采用正交试验优化盐酸提取法和微波提取法提取板栗多糖的工艺条件，并通过两种提取方法的比较，筛选出板栗多糖的最佳提取方法和提取条件，为板栗资源的开发和利用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1试验材料、仪器

板栗采自河北省迁西县白庙子乡李兴庄优种板栗示范采穗园的成熟期的燕龙板栗；葡萄糖标准品，硫酸，苯酚，盐酸等化学试剂均为国产分析纯。

JA2003N电子天平(上海精密科学有限公司生产)；722S型可见光分光光度计(上海光学仪器有限公司生产)；HHiS21电热恒温水浴锅(山东医疗器械厂生产)；YLA-2000电热恒温鼓风干燥箱(黄山市恒丰医疗器械有限公司生产)；Eppendorf 5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司生产)；Jsp-200金穗牌高速多功能粉碎机(浙江省永康市金穗机械制造厂生产)；Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪(美国安捷伦公司生产)；G80W23YCSL-Q3格兰仕微波炉(广东格兰仕集团有限公司生产)。

1.2方法

1.2.1原料预处理将采集后的成熟燕龙板栗置于超低温冰箱，-78 ℃保存30 d。取出后，将板栗去皮，切丁，40 ℃烘48 h，粉碎，过40目筛，放入干燥器中，备用[7]。

1.2.2葡萄糖标准曲线的建立精确移取葡萄糖标准溶液(1 g/L)0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，依次置于25 mL试管中，加水补足至2.0 mL，以2.0 mL的纯净水为空白对照。摇匀后分别加入质量浓度为50 g/L的苯酚溶液1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，混匀，冷却至室温，于490 nm处测定各溶液吸光度(A)。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线。经过线性拟合得到回归方程为：Y=0.047 3x-0.009 8 (R2=0.998)，式中Y表示吸光值；x表示葡萄糖浓度，该方程线性关系良好(R2=0.998)，可以用此方程计算待测溶液中多糖质量浓度。计算板栗总多糖得率。计算公式如下：

Y=[(C×V×稀释倍数)/M]×104

式中:Y为多糖得率(%)，C为由标准曲线计算得到的多糖质量浓度(g/L)，V为样品溶液体积(mL)，M为栗粉总质量(g)。

1.2.3盐酸提取法提取板栗多糖工艺条件优化

① 提取工艺称取板栗粉1 g (精确到0.0001)于三角瓶中，按比例加入一定体积的纯净水，用电热恒温水浴锅提取板栗多糖，通过调节盐酸浓度、提取时间、提取温度及液料比确定最佳工艺。

② 单因素试验选取不同的盐酸浓度(0.24，0.48，0.72，0.96，1.20 mol/L)，不同的提取时间(20，30，40，50，60 min)，不同的提取温度(40，50，60，70，80 ℃)，不同的提取剂用量(20，30，40，50，60 mL/g)进行单因素试验。采用苯酚-硫酸法[8]测定提取液的吸光度值，并计算多糖的得率。

③ 正交试验在单因素试验的基础上，选择盐酸浓度、提取时间、提取温度和提取剂用量为试验因素，以板栗多糖得率为试验指标，采用4因素3水平即L9(34)正交表试验(表1)，优化确定最佳提取工艺条件。

表1　盐酸提取法提取板栗多糖的正交试验因素及水平

1.2.4微波提取法提取板栗多糖工艺条件优化

①提取工艺称取板栗粉1 g(精确到0.000 1)于三角瓶中，按比例加入一定体积的纯净水，用微波炉提取板栗多糖。

②单因素试验选取不同的提取时间(30，40，50，60，70，80 s)，不同的微波强度(800，640，480，320，160 W/g)，和不同的提取剂用量(20，30，40，50，60，70 mL/g)进行单因素试验。采用苯酚-硫酸法[6]测定提取液的吸光度值，并计算多糖的得率。

③正交试验在单因素试验的基础上，选择提取时间、微波强度和提取剂用量为试验因素，以板栗多糖得率为试验指标，采用3因素3水平即L9(33)正交表试验(表2)。优化确定最佳提取工艺条件。

表2　微波提取法提取板栗多糖的正交试验因素及水平

1.2.5不同提取方法对所得板栗多糖分子量分布的测定取适量板栗纯多糖(提取所得多糖经Sevage法去蛋白[9,10]、大孔树脂AB-8吸附法去色素[11]后得到纯多糖)溶于适量蒸馏水中，采用液相色谱法测定两种提取方法所得板栗纯多糖的分子量分布情况。在该方法中以蒸馏水为流动相，以Agilent PL aquagel-OH MIXED-H 8 um 300×7.5 mm为固定相，以Agilent GPC/SEC Calibration Kits为标样，在流速为0.8 mL/min，柱温为35 ℃，检测器温度为35 ℃的条件下在RID检测器上进行检测。

2　结果与分析

2.1盐酸提取法提取工艺优化的试验结果

2.1.1单因素试验结果单因素实验结果表明，盐酸浓度为0.96 mol/L，提取时间为40 min，提取温度为60 ℃，提取液料比为30 mL/g时，板栗多糖得率最高(图1)。此为盐酸提法提取板栗多糖的最佳工艺条件。

2.1.2正交试验结果在单因素试验结果的基础上，选择盐酸浓度、提取时间、提取温度和提取剂用量等4个因素按L9(34)正交表进行板栗多糖提取的正交试验。结果表明，各因素对板栗多糖得率影响的主次顺序依次为：提取温度，提取剂用量，盐酸浓度，提取时间(表3)。通过试验结果理论分析可得最佳组合为：盐酸浓度0.72 mol/L，提取温度70 ℃，提取时间40 min，提取剂用量20 mL/g。

为验证试验结果的可靠性，根据最佳提取条件进行了验证性试验。在最佳提取条件下，板栗多糖的实际得率为18.66 %±2.54%。与预测值相差不大，表明正交试验优化盐酸法提取板栗多糖的条件是可行的，具有实际应用价值。

图1　盐酸提取法提取板栗多糖的单因素试验结果a. 盐酸浓度对板栗多糖得率的影响；b. 提取时间对板栗多糖得率的影响；c. 提取温度对板栗多糖得率的影响；d. 提取剂用量对板栗多糖得率的影响

2.1.3方差分析结果经过正交处理后，用SPSS软件对试验数据进行方差分析，结果(表4)表明，提取温度、提取时间、盐酸浓度及提取剂用量对试验结果的影响均达到了极显著的水平。

表3　盐酸法提取板栗多糖正交试验结果

注：0.72，0.96，1.20为盐酸浓度的3个水平；30，40，50为提取时间的3个水平； 50，60，70为提取温度的3个水平；20，30，40为提取剂用量的3个水平。

表4　盐酸法提取板栗多糖方差分析结果

2.2微波提取法提取工艺优化的试验结果

2.2.1单因素试验结果单因素试验结果表明，提取时间为50 s，微波强度800 W/g，提取剂用量为40 mL/g时，板栗多糖得率最高(图2)。此为微波提取法提取板栗多糖的最佳工艺条件。

2.2.2正交试验结果在单因素试验结果的基础上，选择提取时间、微波强度和提取剂用量等3个因素按L9(33)正交表进行板栗多糖提取的正交试验。结果表明，各因素对板栗多糖得率影响的主次顺序依次为：提取剂用量，微波强度，提取时间(表5)。通过试验结果理论分析可得最佳组合为:提取时间50 s，微波强度800 W/g，提取剂用量30 mL/g。

为验证试验结果的可靠性，根据最佳提取条件进行了验证性试验。在最佳提取条件下，板栗多糖的实际得率为11.87 %±0.87%。与预测值相差不大，表明正交试验优化微波法提取板栗多糖的条件是可行的，具有实际应用价值。

图2　微波提取法提取板栗多糖的单因素试验结果a. 提取时间对板栗多糖得率的影响；b. 微波强度对板栗多糖得率的影响；c. 提取剂用量对板栗多糖得率的影响

表5　微波法提取板栗多糖正交试验结果

注：40，50，60为提取时间的3个水平；480，640，800为提取温度的3个水平； 20，30，40为提取剂用量的3个水平。

2.2.3方差分析结果经过正交处理后，用SPSS软件对试验数据进行方差分析，结果(表6)表明，提取时间、提取剂用量及微波强度对试验结果影响显著。

2.3两种提取方法所得板栗多糖的分子量分布

梁雪[11]通过GPC法测定燕龙板栗多糖的分子量为3.28×105Da；陈和生等[12]通过纸色谱和气相色谱分析表明罗田板栗多糖平均分子量为1.64×105Da。本次研究中，盐酸提取法所得多糖主要峰的分子量大于微波提取法所得多糖主要峰的分子量，且均小于已报道的板栗多糖的分子量。其原因可能是：微波提取法和盐酸提取法在提取的过程中导致板栗多糖降解。本次研究表明：微波提取法对多糖的降解作用强于盐酸提取法(图3，表7)。因此，在提取板栗多糖时，盐酸提取法优于微波提取法。

表6　微波法提取板栗多糖方差分析结果

注：a.R2=0.757 (AdjustedR2=0.625)。

图3　两种提取方法所得板栗多糖的分子量分布图a.盐酸提取法；b.微波提取法

技术名称主要峰的重均分子量Mw/Da盐酸提取法 69776811124微波提取法 2502353

3　结论与讨论

本次试验研究确定了盐酸辅助提取法提取板栗多糖的最佳工艺条件为：盐酸浓度0.72 mol/L，提取温度70 ℃，提取时间40 min，提取剂用量20 mL/g；微波辅助提取法提取板栗多糖的最佳工艺条件为：提取时间50 s，微波强度800 W/g ，提取剂用量30 mL/g。在最佳提取工艺条件下，两种方法提取板栗多糖的得率分别为18.66%±2.54%(盐酸提取法)和11.87%±0.877%(微波提取法)，提取效果较为理想。与微波提取法相比，盐酸提取法不仅原料用量少，多糖得率高，而且对板栗多糖的降解作用小。因此，两种提取方法中，盐酸提取法是燕山板栗多糖提取工艺的较优方法。

[1]杨利剑.板栗多糖的提取、成分分析及活性测定[J].武汉理工大学学报,2010,32(11):14-16.

[2]李润丰,常学东,陈雪娜.板栗多糖提取工艺的研究[J].林产化学与工业，2011,31(2):96-100.

[3]梁雪,杨越冬,杜彬,等.用加压溶剂萃取法提取板栗多糖的工艺条件[J].经济林研究,2013,31(3):98-102.

[4]邵亭亭,张海晖,段玉清,等.亚临界水萃取板栗多糖及其清除自由基活性研究[J].食品科技,2012,37(12):156-160.

[5]邬方宁.超声提取技术在现代中药中的应用[J].中草药,2007,38(2):315-316.

[6]黄雅君，毕红梅，郑文凤，等.超声波辅助法协同酶解提取平菇水溶性多糖的工艺研究[J].黑龙江八一农垦大学学报，2014,26(3)：35-39.

[7]王晓红.板栗多糖类物质提取方法优化与不同品种(系)含量测定[D].秦皇岛:河北科技师范学院,2012.

[8]周振，周能.苯酚—硫盐酸法测定仁东大蒜中的总糖[J].食品研究与开发,2012,33(6):137-142.

[9]Dell A,Morris H R.Glycoprotein structure determination by mass spectrometry[J].Science,2001,291:2 351-2 356.

[10]毛英丽,王忠民,李瑾瑜,等.葡萄多糖脱蛋白方法的研究[J].食品研究与开发,2008,29(4):42-44.

[11]梁雪.板栗不同品种(系) 多糖结构和活性的初步研究[D].秦皇岛:河北科技师范学院，2013.

[12]陈和生,孙振亚,李汉东,等.罗田板栗多糖的分离纯化及成分分析[J].中国药学杂志,2002,37(1):63-64.

(责任编辑：朱宝昌)

Studies on Polysaccharide Extraction Technology of Yanshan Chestnut (CastaneamollissimaBlume)

ZHOU Yan,WANG Xiaohong,WANG Tongkun,FAN Deyue,LIU Junfang

(Hebei Normal University of Science & Technology,Hebei Chestnut Engineering Research Center,Qinhuangdao Hebei,066600,China)

A single-factor experiment and an orthogonal test were employed to determine the optimum conditions to extract polysaccharide from Yanshan chestnut by hydrochloric acid extraction method and microwave extraction method. Meanwhile, phenol-sulfuric acid method and High-performance liquid chromatography were used to compare the differences in polysaccharides’ yield and their molecular weight distribution. The results showed that the optimum conditions of hydrochloric acid extraction were as follows: acid concentration 0.72 mol/L, extraction time 40 min, extraction temperature 70 ℃, extracting agent 20 mL/g, polysaccharide yield 18.66%±2.54%; while the optimum conditions of microwave extraction were: extraction time 50 s, microwave power 800 W/g, extracting agent 30 mL/g, polysaccharide yield 11.87%±0.87%. The hydrochloric acid extraction could significantly increase the yield of chestnut polysaccharide under the optimum extraction conditions. Moreover, the degradation on polysaccharide molecular weight by the hydrochloric acid extraction was smaller than that by the microwave extraction. Thus, the hydrochloric acid extraction might be regarded as the better extraction process to isolate polysaccharide from Yanshan chestnut.

chestnut polysaccharide;extraction process;hydrochloric acid extraction;microwave extraction;yield;molecular weight distribution

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2016.01.003

林业公益性行业科研专项(项目编号:201304708)；河北省科技厅项目(项目编号:14236805D)；河北省自然科学基金项目(项目编号:C2015407036)；河北省教育厅平台建设与基础研究项目(项目编号:16966305D)。

，男，硕士，教授。主要研究方向：果树种质资源。E-mail: trcwhx@126.com。

2015-12-08; 修改稿收到日期: 2016-02-03

TQ914.1

A

1672-7983(2016)01-0014-06

周艳(1991-)，女，硕士研究生。主要研究方向：果树种质资源。