孙 辉， 于 静， 梁 琨， 安 叡， 尤丽莎， 王新宏（上海中医药大学，上海201203）



［成分分析］

3种沙蚕中脂肪酸分析及5种不饱和脂肪酸测定

孙 辉， 于 静， 梁 琨， 安 叡， 尤丽莎*， 王新宏
（上海中医药大学，上海201203）

目的 建立气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法分析疣吻沙蚕Tylorrhynchus heterochaetus、双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis和日本刺沙蚕Neanthes japonica中脂肪酸，并采用GC法测定EPA（二十碳五烯酸）、DHA（二十二碳六烯酸）、AA（花生四烯酸）、LNA（亚麻酸）、LA（亚油酸）含有量。方法 石油醚提取沙蚕中脂肪酸后，氢氧化钾-甲醇溶液将其甲酯化。GC-MS/MS法分析14批样品中主要的脂肪酸成分，NIST库匹配，并计算相对含有量。GC法测定5种不饱和脂肪酸的含有量，通过SPSS16.0软件进行聚类分析。结果 沙蚕中含有18种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含有量较高。5种不饱和脂肪酸线性关系均良好 （r＞0.999 7），加样回收率 （n=6）为94.1%～99.94%。聚类分析将样品分成两类，可鉴别疣吻沙蚕，但不能区分双齿围沙蚕和日本刺沙蚕。结论 该方法稳定可靠，可用于沙蚕的质量评价。

沙蚕；脂肪酸；GC-MS/MS；GC；聚类分析

海洋动物沙蚕隶属于环节动物门多毛纲沙蚕目沙蚕科，是沙蚕科动物的统称，包括1 600多个属，10 000多个种［1］，其既可药用又可食用，还可作为饲料，其经济、营养和生态价值十分显著［2-3］。目前，沙蚕科动物中产量最大和用途最广的3个品种分别是双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis、日本刺沙蚕Neanthes japonica和疣吻沙蚕Tylorrhynchus heterochaetus，其中我国辽宁、山东和河北的沿海地区以双齿围沙蚕和日本刺沙蚕居多，江苏、福建和浙江则以双齿围沙蚕为主，而疣吻沙蚕（俗称禾虫）主要分布在广东、福建和越南等地区［4-5］。

沙蚕含有多种脂肪酸成分，其中不饱和脂肪酸具有较强的生理作用［6-7］。本实验借鉴海洋产物鱼油中不饱和脂肪酸的测定方法，通过气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法对这3个品种沙蚕中的主要脂肪酸成分进行鉴定。同时，建立气相色谱（GC）法对含有量较高，并且在改善心脑血管疾病方面具有显著药理活性的5种不饱和脂肪酸成分EPA（二十碳五烯酸）、DHA（二十二碳六烯酸）、AA（花生四烯酸）、LNA（亚麻酸）、LA（亚油酸）进行定量分析，希冀对沙蚕的质量评价提供有益的参考。

1　材料

1.1仪器 Agi1ent Techno1ogies 7890A GC system、Agi1ent Techno1ogies 7000 GC/MS Trip1e Quad、Agi-1ent6890 N气相色谱仪、Agi1ent ChemStation for GC system工作站、氢火焰离子化检测器（美国Agi1ent Techno1ogies公司）。

LD24型高速中药粉碎机 （浙江省温岭市大海药材器械厂）；YELASB-1100型水浴锅（上海爱朗仪器有限公司）；BT125D型电子天平（德国Sartoris公司）；SK5200H型超声清洗器 （上海科导超声仪器有限公司）；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱 （上海恒科技有限公司）。

1.2试剂、对照品与样品

1.2.1试剂 石油醚 （60～90℃）、甲醇、盐酸、正己烷、氢氧化钾、氯化钠均为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）。

1.2.2对照品 顺，顺-9，12-十八碳二烯酸/亚油酸 （LA）甲酯、全顺式-9、12、15十八碳三烯酸/亚麻酸 （LNA）甲酯、全顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸/花生四烯酸 （AA）甲酯、全顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸 （EPA）甲酯、全顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸（DHA）甲酯（含有量均≥99.0%，美国NUCHEKPREP公司）；十三酸甲酯 （含有量≥99.0%，美国AccuStandard公司）。

1.2.3样品 收集不同产地和品种 （双齿围沙蚕、日本刺沙蚕和疣吻沙蚕）的沙蚕干品，共14批，具体信息见表1。

表1　样品信息Tab.1 Information of samples

2　方法与结果

2.1GC-MS/MS法定性分析脂肪酸成分

2.1.1分析条件

2.1.1.1GC HP-88毛细管柱（100 m×250μm× 0.25μm），程序升温 （初始温度130℃，保持1 min，以5℃/min速率升至160℃，保持20 min，再以3℃/min速率升至240℃，保持17 min）；载气He，体积流量2.25 mL/min；分流比10∶1；进样量1μL。

2.1.1.2MS EI离子源；电子轰击能量70 eV；离子源温度280℃；进样口温度250℃；质子扫描范围m/z33～600。质谱标准库采用NIST谱库。

2.1.2供试品溶液的制备 精密称取沙蚕样品粉末 （过60目筛）适量，加入10倍石油醚，浸泡10～12 h，超声萃取2次 （40 kHz、30℃），每次1 h，溶液过滤，20 mL石油醚冲洗滤渣，过滤，滤液合并，旋转蒸发仪减压蒸馏，回收石油醚，得到沙蚕脂肪油，-20℃保存备用。

精密称取脂肪油样品适量，置于具塞圆底烧瓶中，加0.5 mo1/L氢氧化钾-甲醇溶液5 mL，振荡混匀，于60℃水浴中皂化15 min，冷却后加入25%盐酸溶液10 mL，于60℃水浴中放置15 min，冷却，精密加入正己烷5 mL，振摇，再加入5 mL饱和氯化钠溶液，静置分层，取上清液，无水硫酸钠脱水，6 000 r/min离心5 min，取上清液。精密加入正己烷5 mL，振摇，再加入5 mL饱和氯化钠溶液，静置分层，取上清液，合并上清液，作为沙蚕甲酯化试液，备用。2.1.3 样品测定 按确定的色谱和质谱条件，测定3个不同品种沙蚕中脂肪酸甲酯的总离子流色谱图，见图1。通过NIST库检索匹配，初步鉴定出多种脂肪酸成分，峰面积归一化法计算各成分相对含有量，见表2。而且，不同品种沙蚕中含有18种相同脂肪酸，其相对含有量见表3。

图1　GC-MS/MS总离子流色谱图Fig.1 GC-M S/M S total ion current chrom atogram s

表2　脂肪酸分析结果Tab.2 Analysis results of aliphatic acids

2.2GC法测定5种不饱和脂肪酸的含有量

2.2.1色谱条件 HP-INNOWax Po1yethy1ene G1yco1毛细管柱（29.9 m×530μm×1.00μm）；程序升温（初始温度170℃，保持3 min，以3.5℃/min速率升至205℃，以35℃/min速率升至230℃）；检测器温度280℃；载气为氮气；FID检测器；分流比2∶1；进样量1.0μL。

2.2.2对照品溶液的制备 分别精密称取LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯、LA甲酯对照品适量，正己烷定容，分别制成59.26、28.16、119.49、115.52和138.53 mg/m L溶液，作为对照品贮备液，置于-20℃保存，备用。

2.2.3内标溶液的制备 精密称取十三酸甲酯，正己烷溶解，制成25.00 mg/mL内标溶液，置于-20℃保存，备用。

表3　脂肪酸相对含有量 （%）Tab.3 Relative con tents of aliphatic acids（%）

2.2.4供试品溶液的制备 按 “2.1.2”项下方法，制备各沙蚕脂肪油的甲酯化溶液。精密吸取8 m L，置于10 mL量瓶中，精密加入1 m L内标溶液，正己烷定容至刻度，摇匀，备用。

2.2.5方法学考察

2.2.5.1色谱分离条件的选择 在“2.2.1”项色谱条件下，各成分之间达到完全分离，见图2。

图2　GC色谱图Fig.2 GC chrom atogram s

2.2.5.2线性关系考察 精密吸取LNA甲酯溶液2.5 mL、AA甲酯溶液5 m L、EPA甲酯溶液5 mL、DHA甲酯溶液5 mL、LA甲酯溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，正己烷定容至刻度，摇匀，作为混合对照品贮备液。再分别精密量取0.1、0.25、0.5、1、2、4、8 m L，置于10 m L量瓶中，精密加入1 mL内标溶液，正己烷定容，制成系列质量浓度混合对照品溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积。以各对照品与内标物峰面积之比 （y）对各对照品和内标物质量浓度之比（x）进行回归分析，结果见表4。

表4　5种不饱和脂肪酸甲酯的线性关系Tab.4 Linear relationships of five unsatu rated aliphatic acid methyl esters

2.2.5.3精密度试验 精密量取混合对照品溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下进样1μL，连续6次，测得LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯、LA甲酯峰面积RSD分别为1.8%、2.6%、2.3%、2.9%、2.8%，表明仪器精密度良好。

2.2.5.4重复性试验 精密称取同一批样品 （编号4），按 “2.2.4”项下方法平行制备6份供试品溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下进样1μL，测得LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯、LA甲酯含有量RSD分别为1.9%、1.8%、1.9%、2.8%、1.3%，表明该方法重复性良好。

2.2.5.5稳定性试验 取同一供试品溶液 （编号4），于0、2、4、6、8、10、12 h在 “2.2.1”项色谱条件下进样1μL，测得LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯、LA甲酯峰面积RSD分别为1.8%、1.6%、1.8%、1.8%、2.1%，表明溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.5.6加样回收率试验 精密称取含有量已知的脂肪油样品 （编号4）0.5 g，共6份，加入混合对照品溶液1 mL（每1 mL含LNA甲酯1.823 mg、AA甲酯7.567 mg、EPA甲酯6.462 mg、DHA甲酯2.342 mg、LA甲酯5.708 mg），按“2.2.4”项下方法处理，在 “2.2.1”项色谱条件下进样1μL，计算5种脂肪酸的加样回收率 （n=6）和RSD值。结果，平均回收率为94.1%～99.94%，RSD值均小于3.0%。

2.2.6样品含有量测定 取沙蚕干品，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，在 “2.2.1”项色谱条件下进样1μL，内标法计算LNA甲酯、AA甲酯、EPA甲酯、DHA甲酯和LA甲酯的含有量，再按照式 （1）换算成相应酸的含有量。结果见表5。

脂肪酸含有量=脂肪酸甲酯含有量×脂肪酸分子量/脂肪酸甲酯分子量（1）

表5　含有量测定结果（mg/g，±s，n=3）Tab.5 Results of content determ ination（mg/g，±s，n=3）

表5　含有量测定结果（mg/g，±s，n=3）Tab.5 Results of content determ ination（mg/g，±s，n=3）

编号LNA　AA　EPA　DHA　LA 1　0.57±0.02 2.40±0.04 7.18±0.06 0.38±0.03 1.95±0.03 2　0.68±0.01 1.76±0.01 6.57±0.08 0.50±0.02 1.69±0.02 3　1.35±0.04 4.72±0.03 6.92±0.06 1.77±0.02 2.68±0.04 4　0.54±0.01 3.46±0.02 6.07±0.04 1.50±0.04 2.38±0.03 5　0.73±0.02 4.81±0.05 8.75±0.08 3.03±0.70 3.93±0.03 6　0.43±0.02 1.80±0.03 1.54±0.03 0.56±0.01 1.35±0.02 7　0.28±0.01 1.43±0.04 1.98±0.04 0.79±0.02 1.65±0.04 8　0.53±0.03 1.42±0.03 1.84±0.05 0.75±0.03 2.01±0.02 9　0.32±0.02 0.63±0.04 1.38±0.03 0.67±0.02 1.31±0.02 10 0.14±0.01 0.17±0.01 0.77±0.01 0.39±0.01 1.12±0.03 11 0.78±0.02 0.22±0.03 1.98±0.07 0.43±0.02 0.58±0.05 12 0.40±0.04 0.36±0.01 2.80±0.30 1.30±0.02 0.57±0.04 13 0.37±0.04 0.20±0.02 2.67±0.02 0.56±0.02 0.51±0.04 14 0.26±0.02 0.50±0.01 4.19±0.06 1.36±0.03 0.78±0.02

2.2.7聚类分析 系统聚类是把样品或变量按照相似性进行归类的方法。本实验采用SPSS16.0软件中的聚类分析程序，对3个不同品种14批样品进行聚类分组，采用欧氏距离测量，每两个样本间用Average 1inkage法连结，进行系统聚类分析，绘出树状图，见图3。由图可知，14批沙蚕样品以脂肪酸含有量为聚类变量，样品间距离小于15时聚为1类，可聚成2个大类。其中，样品1～5聚为一类，其他9个样品聚为一类，但两类脂肪酸含有量差异明显，由于1～5均为疣吻沙蚕，因此聚类结果可将其区分开，体现了沙蚕品种的差异性，但不能明显区分双齿围沙蚕和日本刺沙蚕。

3　讨论

本实验采用内标法测定沙蚕中5种不饱和脂肪酸的含有量，由于其含羧基，极性较大，沸点较高，故在分析前先进行甲酯衍生化，以降低沸点和极性，提高分离的有效性，而且选用0.5 mo1/L氢氧化钾-甲醇溶液甲酯化时，方法简便，甲酯化完全。由GC-MS/MS分析结果可知，沙蚕所含脂肪酸种类较多，从十四碳酸至二十四碳酸之间均可检测到。经查阅资料可知，测定脂肪酸甲酯的内标一般选择奇数碳原子［8-9］，故选择十一、十三酸甲酯进行预实验，发现后者不仅可与沙蚕各脂肪酸峰完全分开，而且出峰时间适中。

图3　聚类分析树状图Fig.3 Dend rogram of cluster analysis

通过GC-MS/MS法分析沙蚕脂肪酸成分时发现，沙蚕中含有多种脂肪酸，而且多不饱和脂肪酸约占总量的三分之一。其对人体有重要的生理功能，在体内的平衡对稳定细胞膜功能、调控基因表达、维持细胞因子和脂蛋白平衡、抗心血管病、促进生长发育等方面起着重要作用［10-11］。其中，DHA被称作 “脑黄金”，是大脑和视网膜的重要构成成分，对胎儿、婴幼儿智力和视力发育至关重要，并对人体心血管、神经、抗炎免疫系统等也有着理想的功效［12］；EPA被称为 “血管清道夫”，具有防止脂肪在血管壁的沉积，预防动脉粥样硬化的形成和发展，预防脑血栓、脑溢血、高血压等心血管疾病作用［13］；AA作为各种细胞信号转导途径中不可忽视的第二信使，在细胞膜多种受体刺激后产生并发挥广泛的细胞内生物作用，是人体前列腺素合成的重要前体物质，具有重要的生理、药理作用［14］；LNA是构成人体组织细胞的主要成分，其缺乏是导致老年痴呆、癌症、心脑血管疾病、高血压、高脂血症和糖尿病等疾病的重要诱因；缺乏LA，则会使动物发育不良，导致皮肤和肾损伤等［15］。因此，EPA、DHA、AA、LA和LNA5种脂肪酸对人体的健康非常重要，而分析也发现沙蚕中其含有量均较高。

然后，通过GC法同时测定以上5种不饱和脂肪酸的含有量，可知疣吻沙蚕中EPA、LA和AA的含有量均明显高于其他两类沙蚕。进一步以脂肪酸的含有量为指标进行聚类分析，从聚类树状图可以直观地看出，疣吻沙蚕与其他两类沙蚕 （双齿围沙蚕和日本刺沙蚕）在聚类距离上相距较远。因此，聚类分析能鉴别出疣吻沙蚕。

这些含有量高、种类丰富的脂肪酸显示，沙蚕是一种营养价值高的海洋动物，其中高含有量的不饱和脂肪酸在一定程度上表明了其具有潜在的减少血栓生成等改善心脑血管疾病的药理活性，在开发医疗保健产品方面具有非常大的潜力。

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Analysis of aliphatic acids in three kinds of nereid and determ ination of five unsaturated aliphatic acids

SUN Hui， YU Jing， LIANG Kun， AN Rui， YOU Li-sha*， WANG Xin-hong
（ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine，Shanghai201203，China）

AIM To estab1ish a gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）method for ana-1yzing the a1iphatic acids in Tylorrhynchus heterochaetus，Perinereisaibuhitensis and Neanthes japonica and to determine the contents of EPA（eicosapentaenoic acid），DHA（docosahexaenoic acid），AA（arachidonic acid），LNA（1ino1enic acid）and LA（1ino1eic acid）by GC.METHODS After the a1iphatic acids in nereid were extracted with petro1eum ether，the methy1 esterification was performed by potassium hydroxide-methano1 so1ution. Themain a1iphatic acids in fourteen batches of samp1es were ana1yzed by GC-MS/MS and matched with NIST 1ibrary，whose re1ative contents were ca1cu1ated.The contents of five unsaturated a1iphatic acids were determined by GC.C1uster ana1ysis wasmade by SPSS16.0 software.RESULTS Nereid contained eighteen kinds of a1iphatic acids，and the contents of unsaturated a1iphatic acidswere re1ative1y high.Five unsaturated a1iphatic acids showed good 1inear re1ationships（r＞0.999 7），whose average recoveries（n=6）were94.10%-99.94%.C1uster ana1-ysis divided the samp1es into two groups，which cou1d identify Tylorrhynchusheterochaetus，but fai1ed to distinguish Perinereisaibuhitensis from Neanthes japonica.CONCLUSION Thismethod is stab1e and re1iab1e，which can be used for the qua1ity contro1of nereid.

nereid；a1iphatic acids；GC-MS/MS；GC；c1uster ana1ysis

R284.1

A

1001-1528（2016）06-1298-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.020

2015-07-24

国家 “863”计划项目 （2013AA093002）；上海中医药大学预算内项目 （2014YSN10）

孙 辉 （1991—），女，硕士，研究方向为药物分析与体内过程。Te1：（021）51322450，E-mai1：496148710@qq.com

尤丽莎 （1977—），女，博士，副教授，研究方向为中药活性成分。Te1：（021）51322183，E-mai1：you1isha@126.com