马 志， 孟庆海， 蒯美玉， 林 超， 张亚云， 孙 鑫， 姚 远， 张启春，2， 卞慧敏，2*（.南京中医药大学药学院，江苏南京20023；2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京20023）



桑酮碱对2型糖尿病肾病大鼠的保护作用及机制

马 志1， 孟庆海1， 蒯美玉1， 林 超1， 张亚云1， 孙 鑫1， 姚 远1， 张启春1，2， 卞慧敏1，2*
（1.南京中医药大学药学院，江苏南京210023；2.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏南京210023）

目的 观察桑酮碱 （桑叶总黄酮和总生物碱）对2型糖尿病肾病大鼠的肾功能和肾TGF-β1/Smad信号通路的影响。方法 以高脂联合链脲佐菌素复制2型糖尿病肾病大鼠模型，成模后分为模型组，二甲双胍组，桑酮碱低、中、高剂量组，另设正常空白组10只。灌胃给药，12周后测定各组大鼠空腹血糖及24 h尿量，尿液中白蛋白、肌酐的含有量；取血测定血清肌酐、尿素氮，并计算肌酐清除率；HE染色观察肾脏形态学的变化；Western bo1t方法测定TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、IV型胶原（CoIV）、E钙黏蛋白（E-Ca）的蛋白表达水平；rea1 time PCR方法检测Tgfb1、CoIV和E-Ca的mRNA表达水平。结果 桑酮碱给药组能够显著降低糖尿病肾病大鼠空腹血糖、24 h尿量、尿白蛋白含有量及肌酐清除率，改善肾脏组织病理损伤，下调TGF-β1、p-Smad2/3、CoIV的表达，上调E-Ca表达。结论 桑酮碱能延缓2型糖尿病大鼠早期肾病并发症的发生，其机制与调节肾脏TGF-β1/Smad信号通路有关。

桑酮碱；糖尿病肾病；肾小球滤过率；TGF-β1/Smad通路

糖尿病的发病率逐年升高，特别是2型糖尿病，占糖尿病患者总人数的90%以上，已经严重威胁人类的健康［1］。糖尿病肾病 （diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的并发症之一，已成为导致终末期肾脏病的主要原因［2］。长期的慢性高血糖和血脂代谢障碍导致肾脏血流动力学异常，加速肾功能损害和功能障碍，在糖尿病肾病早期其临床表现为超滤。研究发现，转换生长因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在DN中被认为是关键性因子［3］。前期研究表明桑酮碱不仅能够抑制葡萄糖及多糖的肠吸收，还有增加胰岛素敏感性，改善脂肪代谢等作用［4］。本研究则利用2型糖尿病肾病大鼠模型探讨桑酮碱的防治作用及其对TGF-β1/Smad信号通路的影响。

1　材料与仪器

1.1实验动物 Sprague-Daw1ey大鼠，体质量200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证编号：11400700025240。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2012-0001。实验动物使用许可证号：SYXK（苏）2012-0042。

1.2药物和试剂 桑酮碱 （镇江吉贝尔药业有限公司，批号141119）。桑酮碱是由桑叶中总黄酮和总生物碱按6∶1的比例配比而成。总黄酮以绿原酸为对照，比色法测定含有量为50.4% （主要是绿原酸及其异构体，其中还含少量芦丁与异槲皮苷）。总生物碱中以1-脱氧野尻霉素、荞麦碱、表荞麦碱总和计50.6%。二甲双胍 （北京中惠药业有限公司，批号20130804）；葡萄糖试剂盒 （批号20130402147）、尿素氮试剂盒 （批号20140415）、白蛋白试剂盒 （批号20140427）、肌酐试剂盒 （批号20140404），均由南京建成生物研究所提供；水合氯醛 （南京宁试化学试剂有限公司，批号20131123）；BCA蛋白测定试剂盒 （上海依科赛生物制品有限公司，批号IM000-C021）；链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司，批号1001270674）；TGF-β1抗体、CoⅣ抗体、Smad2/3抗体、p-Smad2/3抗体、E-Ca抗体均由美国Santa Cruze公司提供；二抗羊抗兔IgG-HRP（EnoGene公司）；逆转录试剂盒（美国Thermo公司，批号#K1622）；Trizo1（美国Ambion公司，RET：15596026）；SYBE GREEN（德国Qiagen公司，Cat.NO.204054）；焦碳酸二乙酯水（BIO LINK，BL1005）。

1.3仪器 低速自动平衡离心机 （北京医用离心机厂）；BioTek酶标仪（美国BioTek公司）；ULT1386-5-V42超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific［Ashevi11e］LLC）；164-5051 Western电泳仪（美国Bio-Rad公司）；5417R高速冷冻离心机 （德国Eppendof公司）；梯度热循环仪 （美国App1ied Biosystems）；荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

2　方法

2.1动物模型复制、分组及给药 将SD雄性大鼠150只随机分为对照组10只、高脂饮食组 （140只）。高脂饮食组给予高脂饲料 （配方：10%猪油，20%糖，2.5%蛋黄，67.5%基础饲料）喂养，空白组给予常规饲料喂养，8周后高脂饮食组大鼠一次性腹腔注射STZ（剂量为35 mg/kg）。模型组大鼠出现多尿症状后测定血糖，取血糖值＞16.7 mmo1/L的大鼠为成模大鼠。将成模大鼠随机分为模型组，阳性对照二甲双胍180 mg/kg组，桑酮碱73.5、147、294 mg/kg 3个剂量组，每组20只共100只，实验中死亡大鼠不纳入统计。每日一次灌胃给药，连续12周，模型组和空白组灌胃等容积的水。

2.2标本收集 灌胃给药12周后，代谢笼收集24 h尿液，记录尿量，3 000 r/10 min取上清测量尿液中尿素氮、肌酐、白蛋白的含有量。末次给药后，动物禁食不禁水过夜，水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，3 000 r/min离心10 min取血清测定葡萄糖、肌酐、尿素氮；切取左侧肾皮质称重，用于Western b1ot及rea1 time PCR检测，剩余肾脏置于10%中性甲醛中固定用于病理检查。

2.3肾组织病理形态学观察 10%中性甲醛固定的肾组织常规脱水、包埋、4μm切片，分别行苏木素伊红染色 （HE染色）。光镜下观察肾脏形态学改变情况。根据病变程度分为0级无病变“-”，一级轻度 “+”，二级中度 “++”和三级重度 “+++”，评分分别记为0、1、2、3分。

2.4Western bo1t 检测相关蛋白表达，提取肾脏皮质蛋白，每组3个样本，BCA微量蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，取蛋白样品50μg进行电泳，转膜、封闭、加入一抗4℃孵育过夜，洗涤后加入辣根过氧化酶标记的二抗，孵育，充分洗涤后与ECL化学发光试剂反应，曝光后扫描，用图像分析软件进行光密度分析。

2.5Rea1 time PCR检测相关基因表达 Trizo1提取肾脏皮质总mRNA，每组6个样本，鉴定其浓度及纯度 （A260/A280介于1.8～2.2之间为最佳）。根据逆转录试剂盒说明书逆转录成250 ng/μL cDNA。利用SYBR GREEN检测目的基因的表达。扩增条件：预变性，95℃，10min，共一个循环；变性15 s，退火30 s，延伸30 s，共45个循环；溶解程序，60℃，81个循环。引物序列见表1。

表1　引物序列Tab.1 Primer information

2.6统计学方法 数据以SPSS 19.0软件统计，采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，结果以±s表示，P＜0.05为有显著差异。

3　结果

3.1桑酮碱对2型糖尿病大鼠血糖、24 h尿量、血清肌酐、尿肌酐、和肌酐清除率、尿白蛋白、血清尿素氮的影响 给药前，模型组血糖明显升高（P＜0.01），给药组与模型组间血糖无显著性差异（P＞0.05）。给药12周后，模型大鼠血糖、尿白蛋白、尿素氮、24 h尿量、血清肌酐、尿肌酐、肌酐清除率明显升高，与空白组比较，差异有高度显著性 （P＜0.01）；各给药组均能降低模型大鼠的血糖、24 h尿量、尿白蛋白、尿肌酐、血清肌酐和肌酐清除率，与模型组相比，差异均有高度显著性 （P＜0.01）见表2～3。

表2　桑酮碱对给药12周后DN大鼠血糖、尿白蛋白和血清尿素氮的影响 （±s）Tab.2 Effects of Sangtongjian m ixture on fasting blood glucose，urinary album in and BUN of serum in DN rats after 12 weeks（±s）

表2　桑酮碱对给药12周后DN大鼠血糖、尿白蛋白和血清尿素氮的影响 （±s）Tab.2 Effects of Sangtongjian m ixture on fasting blood glucose，urinary album in and BUN of serum in DN rats after 12 weeks（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01

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表3　桑酮碱给药12周后对DN大鼠24 h尿量、血肌酐，尿肌酐和肌酐清除率的影响 （±s）Tab.3 Effects of Sangtongjian m ixture on 24 h urine volume，serum creatinine，urine creatinine and creatinine clearance in DN rats（±s）

表3　桑酮碱给药12周后对DN大鼠24 h尿量、血肌酐，尿肌酐和肌酐清除率的影响 （±s）Tab.3 Effects of Sangtongjian m ixture on 24 h urine volume，serum creatinine，urine creatinine and creatinine clearance in DN rats（±s）

注：与模型组比较，**P＜0.01

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3.2桑酮碱对2型糖尿病大鼠肾脏形态学变化的影响 HE染色显示，正常组大鼠肾小球结构完整，未见肾小球肥大，肾小球基底膜系膜基质未见明显异常改变，肾小管结构完整；模型组可见肾小球系膜及基底膜显著增厚，与空白组比较有显著差异（P＜0.05，P＜0.01）。桑酮碱组病理改变程度明显减轻，肾小球基底膜增厚程度显著改善，肾小球系膜基质增生程度减轻，与模型组比较，有显著性差异 （P＜0.05，P＜0.01），如图1，病理评分见表4。

图1　桑酮碱对2型糖尿病大鼠肾脏形态学的影响 （HE，×400）Fig.1 Effects of Sangtongjian m ixture on pathomorphology in kidney of DN rats（HE，×400）

表4　桑酮碱对DN大鼠肾脏病理评分的影响（±s，分）Tab.4 Effects of Sangtongjian m ixture on the grade of renal pathology in DN rats（±s，score）

表4　桑酮碱对DN大鼠肾脏病理评分的影响（±s，分）Tab.4 Effects of Sangtongjian m ixture on the grade of renal pathology in DN rats（±s，score）

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　n　　　剂量/（mg·kg-1）系膜及基底膜增生肾小管变性坏死空白组　　10　　-　　0.00±0.00**　　0.00±0.00**模型组　　12　　-　　1.33±0.49　　2.33±0.49二甲双胍组　　14　　180　　0.50±0.52**　　1.50±0.52**桑酮碱组　　12　　73.5　　0.92±0.29*　　1.92±0.29*桑酮碱组　　13　　147　　0.92±0.28*　　1.92±0.28*桑酮碱组　　12　　294　　0.50±0.52**　　1.50±0.52**

3.3桑酮碱对2型糖尿病大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号通路相关蛋白的影响 根据Western bo1t结果显示，12周后模型大鼠肾脏的TGF-β1、CoⅣ、p-Smad2/3的表达升高，E-Ca表达明显降低。桑酮碱给药后能够不同程度的降低TGF-β1、CoⅣ、p-Smad2/3的蛋白表达，提高E-Ca的蛋白表达，与模型组比较，有显著性差异 （P＜0.05，P＜0.01），如图2。

图2　桑酮碱对2型糖尿病大鼠肾脏TGF-β1、Smad、CoⅣ、E-Ca蛋白表达的影响（n=3）Fig.2 Expression of Sangtongjian m ixture on TGF-β1/Smad signal pathway and E-Ca，CoⅣprotein in renal of DN rats（n=3）

3.4桑酮碱对2型糖尿病大鼠肾脏Tgfb1、CoIV和E-Ca mRNA表达的影响 Rea1 time PCR结果显示，模型组大鼠肾脏Tgfb1、CoIV的mRNA水平显著升高，E-Ca的mRNA水平显著降低，与空白组比较，有显著性差异 （P＜0.05）。桑酮碱给药组能够不同程度的降低Tgfb1、CoIV的mRNA水平，提高E-Ca的mRNA水平，与模型组比较有显著性（P＜0.05），如图3。

图3　桑酮碱对糖尿病肾病大鼠肾脏Tgfb1、E-Ca、CoIV m RNA的表达（n=6）Fig.3 Expression of Sangtongjian m ixture on Tgfb1，E-Ca and CoIV mRNA in renal of DN rats（n=6）

4　讨论

用高脂饲料联合低剂量STZ复制糖尿病大鼠模型，是应用最为广泛的糖尿病动物模型，再经12周后逐步发展成肾病并发症。该方法复制的糖尿病肾病大鼠模型与人类早期肾病的改变十分相似，如滤过率升高和蛋白尿增多，肾小球基底膜超微结构的改变以及肾小球系膜扩张［5］。在DN早期，除肾小球结构改变之外，更为显著的是近端小管增生［6］，小管增生后加强重吸收，通过小管反馈使肾小球滤过率升高［7］。因此，在DN早期肾小球清除率升高，这与我们的实验结果一致，即模型组大鼠与空白组比较肌酐清除率显著升高。

研究表明，桑叶中含黄酮类，生物碱类，多糖和酚类化合物等，均具有不同程度的降糖作用［8］。根据本实验结果发现桑酮碱能够显著降低DN大鼠血糖，进一步减轻由高糖导致的超滤，显著降低肌酐清除率即肾小球滤过率，改善肾小球基底膜、系膜增生以及肾小管变性坏死情况，减轻大鼠肾脏代偿作用，对肾脏起到保护作用。桑酮碱改善肾功能的作用与桑叶总生物碱中的特有成分1-脱氧野尻霉素有关，已有文献报道1-脱氧野尻霉素能够改善STZ诱导的糖尿病肾病大鼠的空腹和餐后血糖，改善受损的肾功能［9］。桑叶中的总黄酮有良好的降糖和抗氧化作用，还能够激活肝脏中过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR-γ和PPAR-α提高胰岛素敏感性［10］。桑酮碱中黄酮与生物碱发挥多靶点多效应的作用，通过降低2型糖尿病大鼠血糖，进一步改善其肾功能。

小管间质纤维化是推动糖尿病肾病进程的主要因素之一［11-12］。在糖尿病肾病的状态下发生的上皮间质转换（epithe1ia1-mesenchyma1 transition，EMT）是小管间质纤维化的病理学基础。在EMT过程中发生上皮细胞黏附分子如E-Ca蛋白的缺失，细胞失去黏附性，细胞骨架重塑并且发生形态学的改变进一步导致肾小管基底膜的破坏［13］。目前已经证实抑制TGF-β1的表达能够延缓DN的病程［14］。在DN中，通过TGF-β1激活Smad信号通路参与肾脏纤维化，诱导EMT，促进胶原沉积，降低细胞黏附分子钙黏蛋白E（E-Ca）水平［15-16］。TGF-β1也能够通过Smad3和Smad2调节肾小球系膜细胞肥大、足细胞凋亡，加速肾小球硬化，加重由糖尿病以及其他原因导致的肾脏疾病［17-18］。在本实验中，模型组大鼠的肾脏TGF-β1、p-Smad2/ 3、CoⅣ的表达水平升高，E-Ca的表达水平降低。在给予桑酮碱后，能够不同程度的调节小管间质纤维化，改善肾小球系膜及基底膜增生的情况，与调节TGF-β1/Smad信号通路关系密切。

综上所述，本实验证实了桑酮碱能够改善早期DN大鼠肾功能，其机制与调节TGF-β1/Smad信号通路有关。桑酮碱对实验动物糖尿病及肾病并发症保护作用的机制仍需要进一步研究。

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Effect of Sangtongjian m ixture on rats w ith type 2 diabetic nephropathy

MA Zhi1， MENG Qing-hai1， KUAIMei-yu1， LIN Chao1， ZHANG Ya-yun1， SUN Xin1， YAO Yuan1， ZHANG Qi-chun1，2， BIAN Hui-min1，2*

（1.College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Jiangsu Provincial Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medicine，Nanjing 210023，China）

AIM To observe the effect of Sangtongjian mixture（tota1 f1avones and a1ka1oids from Morusalba）on rats with type 2 diabetic nephropathy（DN）and on TGF-β1/Smad pathway and its mechanism of action. M ETHODS SD rats induced by the combination of STZ and high fat dietwere estab1ished as the DN mode1.The DN rats were divided into mode1 group，metformin group，1ow-，midd1e-，and high-dose Sangtongjian mixture groups.Ten norma1 rats were set as the contro1group.Each treatment group was ora11y given the corresponding agents for twe1ve weeks.The 1eve1s of fasting b1ood g1ucose，24 h urine vo1ume，urinary a1bumin，urine creatinineweremeasured after treatments.Histopatho1ogy changes of kidney were eva1uated by HE staining.Protein 1eve1s of TGF-β1，Smad2/3，p-Smad2/3，CoIV，and E-Ca were determined by Western b1ot；mRNA 1eve1s of Tgfb1、CoIV，E-Ca were eva1uated by rea1 time PCR.RESULTS Sangtongjian mixture group cou1d remarkab1y reduce the 1eve1s of fasting b1ood g1ucose，24 h urine vo1ume，urinary a1bumin，and urine creatinine.Furthermore，Sangtongjianmixture cou1d a1so attenuate the patho1ogica1changes of kidney，down-regu1ate the expression of TGF-β1，p-Smad2/3，CoIV and up-regu1ate the expression of E-Ca.CONCLUSION Sangtongjian mixture can de1ay the progression of ear1y 2 type DN，and theirmechanism of action might be associated with the regu1ation of TGF-β1/ Smad pathway in kidney.

Sangtongjian mixture；diabetic nephropathy；g1omeru1ar fi1tration rate；TGF-β1/Smad pathway

R966

A

1001-1528（2016）06-1215-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2016.06.003

2015-12-30

江苏高校优势学科建设工程资助项目 （PAPD）；国家自然科学基金 （81072985，81573529）

马 志（1990—），女，硕士生，从事中药心血管药理的研究。Te1：18351895531，E-mai1：609438966@qq.com

卞慧敏 （1958—），女，研究员，博士生导师，从事中药心血管药理的研究。Te1：13851495212，E-mai1：hmbian@ sina.com