赵春艳，芦帅△，钟科，孙勇，熊萍，瞿红云（.成都军区机关医院口腔科，四川成都600；.德阳市第二人民医院口腔科，四川68000）

·论著·

基于核磁共振氢谱对健康种植体与健康天然牙龈沟液的代谢组学分析*

赵春艳1，芦帅1△，钟科1，孙勇1，熊萍2，瞿红云1
（1.成都军区机关医院口腔科，四川成都610011；2.德阳市第二人民医院口腔科，四川618000）

目的分析健康种植体与健康天然牙龈沟液（PISF）中的代谢产物，探寻二者PISF的成分构成。方法选取2010年5月至2012年5月于成都军区机关医院种植与修复临床医学专科中心行牙种植术、上部修复已完成、在口内行使功能超过1年的患者13例作为健康种植体组，同期选取健康天然牙13例作为健康天然牙组。采集两组参与者口内健康种植体与健康天然牙周围的PISF，使用核磁共振氢谱（1H-NMR）检测两组PISF，运用主成分分析及正交信号校正-偏最小二乘法进行数据分析，比较健康种植体与健康天然牙周围的PISF的成分。结果健康种植体组与健康天然牙组周围组织的改良菌斑指数、牙龈出血指数、PISF指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），而牙周探诊深度/种植体周探诊深度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。1H-NMR图中健康天然牙组较健康种植体组谱峰稍多，谱峰位置基本一致。主成分分析发现两组没有明显差异，数据归一化处理后进行偏最小二乘法分析，发现两组数据相互交叉，不能区分开。结论健康种植体与健康天然牙周围的PISF成分没有明显差异。

磁共振波谱学；牙种植体；牙龈缝液；主成分分析

【Abstract】Objective To analyze themetabolites of the peri-implantsulcular fluid（PISF）ofhealthy implantsand natural teeth and to explore their component constituent.Methods Thirteen cases of teeth implantation，completing upside repair and conducting oral function for over 1 year in the Institution Hospital of Chengdu Military Region from May 2010 to May 2012 were selected as the healthy implantation teeth group and contemporaneous 13 cases ofhealthy natural teeth were selected as the healthy natural teeth group.PISE around healthy implants and healthy teeth was collected and detected by using 1 hydrogen nu clearmagnetic resonance（1H-NMR）.The principal component analysis and OSC-PLSmethod were applied for the data analysis.The constituents of PISF were compared between the healthy implants and health natural teeth.Results There were no significant differences inmPLI，GBIand PISF indexes between the healthy dental implant group and the healthy natural teeth group （P＞0.05），and the difference in PD/PPDwas statistically different between them（P＜0.05）.In the1H-NMR spectroscopy，the spectrum peaks in the healthy natural teeth group were slightly more than those in the healthy implantgroup，the spectral peak positions were basically consistent.The principal componentanalysis found that there were no significant differences between the two groups.After the data normalization，the partial leastsquaremethod wasused to analyze the data.The data of the two groupswere found to be cross and not separated.Conclusion The components of PISF have no significant difference between healthy implantsand healthy natural teeth.

【Key words】Magnetic resonance spectroscopy；Dental implants；Gingival crevicular fluid；Principal component analysis

种植义齿与活动义齿、固定义齿相比，具有美观、舒适、功能恢复好、不损伤邻牙等优点，目前已成为缺牙修复最重要的方式之一。随着种植技术的发展，种植体成功率越来越高。种植体成功的主要原因在于与周围骨组织形成良好的骨整合现象，这是保证种植体能行使功能的首要条件。然而，种植体周围组织与天然牙存在一定的差异，种植体与周围骨组织直接结合，天然牙通过牙周膜与骨组织连接。龈沟液（PISF）可以反映牙周组织及种植体周围组织的生理状态，通过对PISF的研究，可以了解种植体与天然牙PISF成分的构成。

代谢组学是研究生物体内参与生物体新陈代谢，维持正常生理功能和生长发育代谢产物的有效方法［1］；其分析手段有核磁共振技术、高效液相色谱、气相色谱、质谱及其联用技术［1-2］，其中，核磁共振技术（nuclearmagnetic resonance，NMR）是最常用的分析技术之一。本实验运用基于核磁共振氢谱（1H-NMR）的代谢组学技术研究健康种植体与健康天然牙PISF的成分构成。

1　资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料本研究选取2010年5月至2012年5月于成都军区种植与修复临床医学专科中心行牙种植术（种植体为德国Bego骨水平种植体），上部修复已完成，在口内行使功能超过1年的患者13例（13颗种植牙）作为健康种植体组，其中男8例，女5例；年龄39～74岁，平均（55.7±8.3）岁。同期选取健康天然牙13例作为健康天然牙组，要求牙周组织健康。首选健康种植体的对侧同名牙；若对侧同名牙牙周有炎症或缺失，则选择对颌同名牙或健康邻牙。两组样本来源相同，一般资料一样；本研究通过医院伦理委员会批准同意；所有患者均告知相关实验内容并取得患者同意，均签署知情同意书。

1.1.2纳入标准全身健康状况良好，无系统性疾病；口内部分牙缺失，种植修复已完成且在口内正常行使功能超过1年；一期手术均为潜入式，术后6个月行二期手术，安装愈合基台；无夜磨牙，咬合关系正常、种植义齿无咬合创伤者。

1.1.3排除标准吸烟、酗酒者；妊娠及哺乳期妇女；近3个月有牙周或种植牙周治疗史；近3个月服用过抗生素或免疫制剂；常规牙科治疗需抗生素预防者。

1.2方法

1.2.1研究方法采集参与者口内健康种植体与健康天然牙周围的PISF。检查临床指标，滤纸条法采集PISF，滤纸条称质量法测定PISF的量（mg）。使用Bruker600MHz核磁共振仪对样品进行检测，实验温度为298 K，脉冲序列为cpmgpr1d。设置采样参数如下：循环等待时间为5 s，弛豫延迟时间为5 s，谱宽为12 335.526 Hz，采样时间为2.656 4 s，采样点数为32 768个，累加次数64次，预饱和方式抑制水峰。以D2O为溶剂，以溶剂峰为内标，获得26个样本的原始自由感应衰减信号。

将其导入MestReNova-6.1.1统计软件，自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线，以Acetate峰（1.9 ppm）作为全部谱图化学位移的标准。对0.1～10.0 ppm的谱峰进行分析，以0.04 ppm单位的化学位移为分段积分单元。归一化处理，导出数据，得到每个分段和对应的积分面积值的矩阵，得到1H-NMR图和分段积分值。将保存的Excel表格中的数据输入到SIMCA-P 11.5软件进行多元统计分析。先进行主成分分析（principal components analysis，PCA）。PCA分析后对数据进行正交信号校正（orthogonal signal correction，OSC），可以消除个体差异等干扰因素对组间差异的影响，之后进行偏最小二乘法（partial leastsquares，PLS）分析。

1.2.2检测指标

1.2.2.1改良菌斑指数（mPLI）评分标准［3］0分为龈缘无菌斑；1分为无肉眼可见菌斑，只有探针尖端轻划过牙面或种植体表面才能发现；2分为龈缘有肉眼可见菌斑；3分为大量菌斑和软垢。

1.2.2.2牙龈出血指数（GBI）参考Löe［4］牙龈指数并适当修改，评分标准如下：0分为牙龈健康，牙龈颜色、点彩正常，探诊无出血；1分为牙龈颜色、点彩正常，探诊无出血，轻度充血；2分为牙龈充血呈红色，点彩消失，探诊出血；3分为牙龈明显红肿，指压出血。

1.2.2.3牙周探诊深度（PD）的测量以20～25 g的压力探诊待检牙或种植体的唇（颊）侧近中、中央、远中，舌（腭）侧近中、中央、远中6个位点，记录探诊深度，取平均值作为本次的最终测量值。

1.2.2.4种植体周探诊深度（PPD）的测量参考Lang等［5］和Heuer等［6］的方法，采用高分子刻度树脂探针进行检测。以20 g的压力探诊待检牙或种植体唇（颊）侧近中、中央、远中，舌（腭）近中、中央、远中6个位点，记录探诊深度，取平均值作为本次的最终测量值。

为避免临床检查对PISF质量的影响，先检查待检牙的mPLI，之后采集PISF，再依次检查GBI、PD或PPD，最后进行影像学检查。均采用高分子树脂刻度探针进行探诊。

1.3统计学处理1H-NMR分析运用SIMCA-P 11.5软件进行主成分分析，对数据进行OSC后进行PLS分析。应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，mPLI、GBI、PPD、PISF等计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.3.2

2　结果

2.1两组周围组织的临床指标分析健康种植体组与健康天然牙组周围组织的mPLI、GBI、GCF/PISF指标比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），而PD/PPD比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。注：与健康天然牙组比较，aP＜0.05。

表1　健康天然牙及种植体周围组织不同状态的临床指标（±s）

表1　健康天然牙及种植体周围组织不同状态的临床指标（±s）

组别健康天然牙组健康种植体组0.95±0.63 0.93±0.73 0.19±0.10 0.19±0.10 0.97±0.29 1.74±0.35a10.48±0.59 10.53±0.60 mPLI（分）GBI（分）PD/PPD（mm）PISF（mg）

2.2两组周围PISF的核磁共振分析1H-NMR图中健康种植体组与健康天然牙组谱峰的多少、高低有一定的差异，健康天然牙组谱峰稍多，谱峰位置基本一致。主成分分析发现两组没有明显差异，两组数据归一化处理后进行PLS分析，发现两组数据相互交叉，不能区分开，见图1。

图1　两组周围PISF 1H-NMR波谱图

3　讨论

代谢组学是一种研究生物体内参与生物体新陈代谢、维持正常生理功能和生长发育代谢产物的有效方法［7］；该技术广泛应用于疾病的诊断与预测、微生物学的研究、药物的代谢路径及疗效、营养学、环境学等领域。代谢组学的分析手段有核磁共振技术，高效液相色谱、气相色谱、质谱及其联用技术［1］。NMR是其中最常用的分析技术，其不破坏待检样品，无偏性，高通量和低检测成本，样品不需要复杂预处理，便可检测大多数物质［8］。基于NMR的代谢组学技术广泛应用于疾病诊断、药理研究和临床前毒理等方面发挥了重要作用［9-10］。

种植体周围软组织结构类似于天然牙牙周组织，种植体周围的结合上皮及龈沟上皮围绕种植体形成软组织环形封闭，在结合上皮上方，龈沟上皮与植体之间形成类似于牙龈沟的解剖结构［11］。PISF是由沟内上皮下结缔组织中的物质渗透到龈沟内形成的，其成分主要来自牙周组织、血清及牙菌斑中的微生物，包括各种电解质、葡萄糖、蛋白质、酶、补体-抗体系统等，也含有少量白细胞及脱落上皮细胞等［12］。PISF是一种组织渗出液，其流出量与牙周组织的炎症程度成正比［13］，PISF的流量和成分可以反映牙周组织的健康状况［14］。在组织学形态及生化特征上，种植体周围龈沟与天然牙龈沟均有相似的地方；种植体周围PISF也含有参与炎性反应、免疫反应的各种因子和酶。本研究将健康种植体和健康天然牙PISF量进行比较，结果显示二者无显著差异。这与众多学者的研究结果一致［15-16］，证明健康种植体和健康天然牙分泌的PISF量相近。

PISF主要来自血清及牙菌斑中的细菌。牙菌斑在牙周堆积，产生一些大分子产物，这些产物扩散并聚集在牙龈上皮基底膜处，产生持续的渗透梯度，使组织液渗出至龈沟内，形成PISF［12］。研究表明随着牙菌斑堆积时间延长，PISF的量会增多［16］。牙龈健康者牙周仅有少量牙菌斑，所以PISF的量也极少。有研究证实，健康种植体及健康天然牙周围的龈下微生物群落组成及结构相似，分泌到PISF中的成分相似。纯钛种植体及其上部结构生物安全性和生物反应性好，对周围组织无毒、无刺激、不致敏、不产生免疫排斥，能与牙周组织保持良好的反应性和结合性，保持稳定的状态。纯钛表面能吸附清蛋白、纤维粘连蛋白、胶原酶等蛋白分子，促进细胞附着；同时也支持组织细胞的生长、增殖和分化，不会对周围组织的代谢形成干扰［16］。健康天然牙及健康种植体周围PISF的成分相似。

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M etabonom ics analysis of gingival sulcus fluid of healthy imp lant and healthy natural teeth based on nuclear magnetic resonancehydrogen spectroscopy*

ZhaoChunyan1，Lu Shuai1△，Zhong Ke1，Sun Yong1，Xiong Ping2，Qu Hongyun1（1.Department of Stomatology，Institution HospitalofChengdu Military Region，Chengdu，Sichuan 610011，China；2.Department of Stomatology，DeyangMunicipalSecond People′sHospital，Sichuan 618000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.08.004

A

1009-5519（2016）08-1130-03

成都军区面上课题（C14051）。

赵春艳（1988-），硕士研究生，主要从事口腔种植修复研究。

△，E-mail：lushuai@163.com。

（2016-01-28）