林　牧，龚亚东，高绍莹，田　进，何　健，马庆庆（贵州航天医院中心实验室，贵州遵义563000）

实时定量聚合酶链反应在肺结核早期诊断中的价值

林牧，龚亚东，高绍莹，田进，何健，马庆庆△
（贵州航天医院中心实验室，贵州遵义563000）

目的探讨实时定量聚合酶链反应（RQ-PCR）在肺结核早期诊断中的价值及对结核分枝杆菌检出率较抗酸染色的优势。方法收集2015年7～8月疑似结核患者痰液标本191份，分别采用RQ-PCR和抗酸染色检测标本中结核分枝杆菌并进行比较。结果RQ-PCR检测阳性率［27.75%（53/191）］显著高于抗酸染色［9.95%（19/191）］，差异有统计学意义（χ2=1.43，P＜0．01）；RQ-PCR检测灵敏度、约登指数较抗酸染色高，抗酸染色检测特异性较RQ-PCR高，综合各项指标以RQ-PCR较好。结论RQ-PCR对结核分枝杆菌的检测具有高特异性、灵敏度及快速、简便等特点，在肺结核早期诊断中具有很好的参考价值，可作为诊断肺结核的常规方法，适合在临床推广应用。

聚合酶链反应；结核，肺/诊断；染色与标记；早期诊断

肺结核是因结核分枝杆菌侵入肺部所致的慢性传染性疾病，在结核感染中最为常见［1］。世界卫生组织评估结果显示，目前我国结核病发病人数约为每年130万人次，占全球总发病人数的14%左右，仍位居全球第2位［2］。检查肺结核的手段较多，常见为痰结核分枝杆菌涂片、抗酸染色、结核菌素试验、影像学检查、改良罗氏痰培养鉴定等，其中以抗酸染色临床应用较普遍，但其灵敏度较低，故对临床应用产生较大影响［3］。实时定量聚合酶链反应（real time quantitative-polymerase chain reaction，RQ-PCR）20世纪90年代被应用于临床结核诊断，随着分子诊断学的发展，RQ-PCR在结核早期诊断中具有较高灵敏度、特异性及简便、快速等特点［4］。本研究采用RQ-PCR与痰涂片抗酸染色对191例疑似结核患者痰液标本的诊断结果进行了比较分析，旨在探究RQ-PCR在肺结核早期诊断中的价值和临床应用意义。

1　资料与方法

1．1资料

1.1.1标本来源收集2015年7～8月送至本实验室的191例疑似结核患者痰液标本。所有标本均用密封痰盒存放保存并在24 h内检测。

1.1.2仪器与试剂7500型RQ-PCR仪（美国ABI公司）、质控品［厦门泰普生物科学（中国）有限公司］、结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（RQ-PCR）等。

1．2方法对临床送检的同一例肺科疑似结核患者的合格标本分别采用抗酸染色和RQ-PCR进行检测。

1.2.1抗酸染色依据中国结核病防治规划，即《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》的要求进行检测。阳性结果为1+～4+。

1.2.2RQ-PCR（1）准备八连管，每孔加入PCR反应液44 μL、Taq酶1 μL，-20℃保存备用。（2）根据痰液标本具体情况加入4%氢氧化钠，一般为痰液体积的2～4倍；密闭后摇动混匀，室温存放过夜以便痰液充分液化；次日取1 mL液化后痰液标本至去酶的1．5 mL离心管内，13 000 r/min离心10 min后弃上清液；沉淀中加无菌生理盐水1 mL左右，混匀洗涤后13 000 r/min离心10 min，再用无菌生理盐水重复洗涤1次并离心；向沉淀中加50 μL DNA提取液，混匀后瞬离；100℃金属浴15 min后13 000 r/min离心10 min；取上清液5 μL加至预先分装好反应体系的八连管中（含反应液及Taq酶共45 μL），配制为50 μL反应体系，采用RQ-PCR仪进行检测。（3）取阴性质控品和阳性质控品各50μL，再加入等量DNA提取液，震荡混匀后瞬离；100℃金属浴10min后13000r/min离心10 min；取上清液5 μL加至预先分装好反应体系的八连管中（含反应液及Taq酶共45 μL），配制为50 μL反应体系，采用RQ-PCR仪进行检测。（4）PCR扩增，以37℃2 min，94℃2 min，94℃15 s至55℃45 s扩增40个循环，荧光信号收集设置为55℃。实验结果根据检测试剂盒说明书结果判断标准进行分析。评价2种方法诊断早期肺结核的灵敏度、特异性及约登指数。

1.3统计学处理应用SPSS17．0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.12种方法检测结果比较191例肺科疑似结核患者痰液标本RQ-PCR检测阳性率［27.75%（53/191）］显著高于抗酸染色［9.95%（19/191）］，差异有统计学意义（χ2= 1.43，P＜0．01）；2种方法检测均为阳性19例，均为阴性138例，见表1。

表1　2种方法检测结果比较（n）

2.2方法学评价结果RQ-PCR检测灵敏度为100.00%、特异性为72.25%，抗酸染色检测灵敏度为35.85%，特异性为100.00%；RQ-PCR检测的约登指数为0.723，抗酸染色检测的约登指数为0.358，见表2。

表2　方法学评价结果

2.3Taq酶探针RQ-PCR检测阳性标本的标准曲线扩增曲线处除未出现特异性扩增的阴性对照曲线外大致分为3种形态：（1）Ct值从12开始上扬的曲线，形状呈标准的“S”形，说明该样本中含有的结核分枝杆菌数量很多；（2）Ct值从22～26区间开始上扬的曲线，形状基本呈“S”形，说明该样本中含有的结核分枝杆菌数量较多；（3）Ct值从30开始上扬的曲线，形状暂无法看出呈现“S”形，但若再经过数个循环后便会出现“S”形曲线，说明该样本中含有一定数量的结核分枝杆菌，能诊断为肺结核阳性，见图1。

图1　Taq酶探针RQ-PCR检测阳性标本的标准曲线

3　讨　论

我国结核分枝杆菌感染率一直保持较高水平，其中以肺结核多见，是一种较为常见的传染病［5］。随抗生素的滥用结核呈现出多重耐药性、高度传染性及治疗困难性等，导致肺结核成为全球性严重公共卫生问题。肺结核传统诊断方法为直接涂片抗酸染色检查结核分枝杆菌；抗酸染色优点是成本较低、简便、快速，几小时便可获取检测结果，尤其适于基层医院的结核诊断；但其缺点也很多，如无法区别结核分枝杆菌、非结核分枝杆菌；其中最大的缺点是灵敏度低，检测结核分枝杆菌时需含菌量为5 000～10 000 cfu/mL才能检出，对痰液中含菌量少的肺结核患者其灵敏度就更低，极易造成误诊，加大用药错误的风险［6-7］。RQ-PCR是在常规PCR基础上加入荧光探针，利用荧光信号积累计算Ct值，从而测定核酸量；通过Taq酶5′～3′外切酶选取结核分枝杆菌的基因保守片段扩增，因不受细胞表型影响而特异性较高［8］。基因扩增后目标核酸片段放大百万倍，使其具有极高的灵敏度；整个过程在全封闭状态下进行，有效避免了扩增产物污染导致的假阳性情况。同时高度的重复性和快速性使其具有一定的临床应用优势，只需2 h左右即可完成检测，特别适合结核分枝杆菌这类生长缓慢细菌的检测［9-10］。

本实验采用RQ-PCR、抗酸染色对比分析了191例肺科疑似结核患者的痰标本，结果表明，RQ-PCR检测阳性率（27.75%）显著高于抗酸染色（9.95%），差异有统计学意义（P＜0．01）；RQ-PCR法检测的灵敏度为100.00%、特异性为72.25%，抗酸染色检测的灵敏度为35.85%、特异性为100.00%，说明RQ-PCR敏感度高，可提高结核分枝杆菌检出率，与国外其他研究结果基本一致［10］。约登指数是评价筛查试验真实性的方法，表示筛检方法发现真正的患者与非患者的总能力，指数越大说明筛查实验的效果越好，真实性越大［11］。本研究结果显示，RQ-PCR检测的约登指数为0.723，抗酸染色检测的约登指数为0.358。本研究只用阴、阳性表示结果，实际上RQ-PCR可做到相对定量检测（图1），其定量检测结果可指导临床用药、评估疗效、提供诊断和筛选指标。但由于使用4%氢氧化钠对痰液标本进行液化时无固定的加入量，所得到的定量结果是不准确的，故本研究只对定性结果进行了统计分析。

综上所述，作者认为，RQ-PCR具有较高的灵敏度和特异性，具有快速、敏感、操作简便等特点，且RQ-PCR检出阳性率更高，其定量结果可指导临床用药和评估疗效，用于结核病的快速诊治更具有积极意义，可作为肺结核诊断的常规方法。

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10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.040

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1009-5519（2016）06-0906-03

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（2015-11-12）