李　妍，孙　安，牛彩琴（.静宁县人民医院，甘肃平凉743400；.兰州军区空军机关医院特诊科，甘肃兰州73000；3.川北医学院中西医临床医学系，四川南充637007）

苦豆子总碱对糖尿病性膀胱病大鼠逼尿肌活动的影响*

李妍1，孙安2，牛彩琴3△
（1.静宁县人民医院，甘肃平凉743400；2.兰州军区空军机关医院特诊科，甘肃兰州730020；3.川北医学院中西医临床医学系，四川南充637007）

目的观察苦豆子总碱（TASa）对糖尿病性膀胱病（DCP）大鼠膀胱逼尿肌活动的影响。方法（1）采用链脲佐菌素法建造糖尿病模型；（2）测定尿流动力学指标确立DCP模型；（3）采用恒温灌流浴槽，将大鼠膀胱逼尿肌离体肌条标本分为对照组（正常肌条，12份）和DCP模型组（DCP肌条，72份），再将DCP模型组分为TASa组、TASa联合异搏定（维拉帕米）组、TASa联合酚妥拉明组、TASa联合苯海拉明组、TASa联合消炎痛（吲哚美辛）组和TASa联合阿托品组，各12份。探讨TASa对DCP逼尿肌自发收缩的影响。结果TASa能增强DCP膀胱逼尿肌自发收缩的振幅，并具有量效依赖性（r=0.89，t=3.39，P＜0.05）；用线性回归法计算半数有效浓度为23.79 mg/L；但对频率［DCP模型组为（4.48±0.17）次/分，TASa组为（4.50±0.09）次/分］无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05）；异搏定能明显抑制TASa收缩膀胱逼尿肌的作用，而阿托品、酚妥拉明、苯海拉明和消炎痛无影响。结论TASa可能是激活钙离子通道而增加DCP大鼠膀胱逼尿肌的收缩。

苦豆子；生物碱类；膀胱疾病；糖尿病并发症；尿动力学；逼尿肌

糖尿病性膀胱病（diabeticcystopathy，DCP）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常见慢性并发症之一，发病率为40%～80%，有膀胱充盈的感觉障碍、膀胱容量增大、逼尿肌收缩无力和残余尿量增加及尿急、尿失禁等相应症状［1-3］。目前认为，可能是支配膀胱的神经、逼尿肌细胞、膀胱上皮功能障碍及由腺苷二磷酸-核糖聚合酶（adp-ribose-polymerase，ADP）参与逼尿肌细胞凋亡等多因素共同作用的结果［4］。临床对DCP仍缺乏有效的治疗方法，且对DM的治疗也未减少其发病率。苦豆子总碱（total alkaloids of sophora alopecuroids，TASa）是从中药苦豆子干燥全草和种子提取的总生物碱，具有清热解毒、祛风燥湿作用［5］，能增加正常膀胱逼尿肌、子宫、胆囊和胃肠平滑肌的收缩［6-9］。但对DCP模型大鼠膀胱逼尿肌的影响尚鲜见文献报道。本研究将DCP逼尿肌离体肌条置于灌流浴槽，观察TASa对DCP膀胱逼尿肌活动的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物选取清洁级健康成年Wistar大鼠40只，体质量200～250 g，雌雄不拘，由兰州大学实验动物中心提供，合格证号：医动字第14-006号。

1.1.2药品与试剂TASa购于兰州大学第一附属医院，批号20040301，TASa≥95%，用生理盐水配制成5、10、20、40、80 mg/L备用，用碳酸氢钠配制为pH 7.4；异搏定（verapamil，Vera，维拉帕米）和阿托品（atropine，A-tro）均购于上海禾丰制药有限公司，批号分别为00701、000916；苯海拉明（benzhydramine，Denz）购于江苏兴化制药厂，批号 00032331；酚妥拉明（phetolamine，Phet）、消炎痛（indomethacin，Indo，吲哚美辛）和链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）均购于Sigma公司，批号分别为20000502、01595、S0130；Krebs-Henseleit（K-H）液等其他试剂均为化学分析纯。

1.1.3仪器6套离体恒温灌流肌槽（兰州大学化学系玻璃仪器厂）、2台IBM电脑［内置Biolap410（BL-410）智能型生物信号处理系统（成都泰盟电子有限公司）］、张力传感器（JH-2，中国北京航天医学工程研究所）、One Touch Horion血糖仪、血糖纸（深圳强生医疗器材有限公司）、721分光光度仪（上海天普分析仪器有限公司）、PX359-300A5V型生理压力传感器（美国Omega公司）、WZ-50C6型微量灌注泵（美国Smith公司）等。

1.2方法

1.2.1建立DM动物模型将40只Wistar大鼠随机分为对照组（正常大鼠10只）和模型组（DM大鼠30只），实验前禁食18～24 h，饮水不限。对照组一次性腹腔注射0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液2 mL/kg；模型组一次性腹腔注射用0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液配置的2%STZ 60 mg/kg。3 d后禁食，不禁饮6 h，采尾血测空腹血糖，以血糖持续1周大于或等于16.9 mmol/L为DM模型造模成功［10-12］。

1.2.2确立DCP动物模型DM造模10周后测两组大鼠尿流动力学和膀胱湿质量。用戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔麻醉，仰卧固定，下腹正中切开暴露膀胱；用6号注射针头经膀胱顶部穿刺置入PE-50导管。膀胱内导管经三通阀分别与PX359-300A5V型生理压力传感器和WZ-50C6型微量灌注泵相连，近膀胱入口处切断双侧输尿管并结扎远端。平衡30 min吸尽膀胱内尿液后再缓慢灌注无菌生理盐水（0.08 mL/min）。记录膀胱容量、顺应性、膀胱内最大压力和残余尿量。参照大鼠不稳定膀胱判定标准，在膀胱低压充盈期出现膀胱内压升高超过15 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）即为不稳定膀胱［13-14］。根据尿流动力学检测结果，若逼尿肌顺应性增大、残余尿增多、最大膀胱容量增大、逼尿肌收缩减弱则确立为DCP造模成功。

1.2.3离体肌条的制备测完尿流动力学指标和称质量后切取纵行肌条（6 mm×2 mm）标本36份，置于37℃恒温灌流浴槽，并通入95%氧和5%二氧化碳气体，记录肌条的活动［6-9］。

1.2.4离体肌条标本的分组及处理

1.2.4.1TASa对DCP逼尿肌肌条收缩的影响取正常肌条标本12份作为对照组，DCP肌条标本24份分别作为DCP模型组和TASa组，各12份。对照组、DCP模型组加等量生理盐水，TASa组每2分钟累积加入TASa使其终质量浓度为（5、10、20、40、80 mg/L），测量肌条的活动。

1.2.4.2阻断剂对TASa增强DCP肌条收缩的影响取DCP肌条标本72份，分为TASa组、TASa联合Vera （10-7mg/L）组、TASa联合Phet（10-6mg/L）组、TASa联合Denz（10-6mg/L）组、TASa联合Indo（10-6mg/L）组和TASa联合Atro（10-6mg/L）组，各12份。向浴槽分别加入阻断剂温育2min后，再依次加入TASa（20mg/L），测量其变化。

1.2.5观测指标采用One Touch Horion血糖仪测大鼠尾血空腹血糖。记录膀胱容量（至排尿时所灌注的生理盐水量）、膀胱内最大压力（排尿时膀胱内最大压力的峰值）、残余尿量（排尿后经膀胱内导管吸出的剩余生理盐水量）、逼尿肌顺应性（膀胱容量改变与压力改变比值（△V/△P）等。测量给药后2 min离体肌条收缩振幅（g）和频率（次/分），计算每分钟收缩波的次数。

1.3统计学处理应用SPSS11.0统计软件进行数据分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，多组之间比较采用方差分析；采用线性回归法计算半数有效浓度（EC50）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1DM动物模型造模3 d后DM组大鼠空腹血糖为（30.50±0.76）mmo/L，始终维持在16.7 mmol/L以上，对照组大鼠血糖为（5.54±0.27）mmo/L，低于7.0 mmo/L，两组大鼠空腹血糖比较，差异有统计学意义（t=24.18，P＜0.01）。10周后DM组大鼠体质量［（216±4）g］明显低于对照组［（473±9）g］，差异有统计学意义（t=22.78，P＜0.01）。

2.2DCP动物模型DCP组大鼠膀胱质量、容量、最大压力、剩余尿量和顺应性明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1　两组大鼠膀胱质量和尿流动力学检测指标比较（±s）

表1　两组大鼠膀胱质量和尿流动力学检测指标比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01。

组别n　膀胱质量（m g）膀胱容量（m L）剩余尿量（m L）顺应性（m L / c m H2O）对照组D C P模型组1 0 3 0 9 1 . 5 0 ± 1 4 . 3 2 2 3 7 . 8 3 ± 3 2 . 0 7a膀胱最大压力（c m H2O ）1 . 1 1 ± 0 . 2 1 3 . 1 5 ± 0 . 4 1a6 2 . 5 6 ± 1 0 . 8 2 7 3 . 8 6 ± 9 . 7 1a0 . 0 5 ± 0 . 0 1 0 . 4 8 ± 0 . 0 5a0 . 0 5 ± 0 . 0 1 0 . 1 5 ± 0 . 0 3a

2.3TASa、阻断剂对DCP逼尿肌收缩的影响TASa能增加DCP大鼠逼尿肌收缩的振幅和频率，且振幅具有量效依赖性（r=0.89，t=3.39，P＜0.05）；Vera能明显抑制TASa收缩逼尿肌的作用，差异有统计学意义（P＜0.01）；Phet、Denz、Atro、Indo则对TASa收缩逼尿肌的兴奋作用无影响，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1～3、表2。

图1　对照组大鼠膀胱逼尿肌的活动

图2　TASa对DCP大鼠膀胱逼尿肌活动的影响

图3　TASa对DCP大鼠膀胱逼尿肌活动的影响

表2　阻断剂对TASa增强DCP大鼠逼尿肌的影响（±s）

表2　阻断剂对TASa增强DCP大鼠逼尿肌的影响（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与DCP模型组比较，bP＜0.01；与TASa组比较，cP＜0.01。

组别n 阻断剂（m g / L ）T A S a （m g / L）　振幅（g）　频率（次/分）对照组D C P模型组T A S a 组T A S a联合V e r a 组T A S a联合P h e t 组T A S a联合I n d o 组T A S a联合D e n z 组T A S a联合A t r o 组1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 0 0 0 1 0-71 0-61 0-61 0-61 0-60 . 0 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 2 0 . 0 1 . 0 6 ± 0 . 0 2 0 . 6 5 ± 0 . 0 3a0 . 8 9 ± 0 . 0 5b0 . 6 1 ± 0 . 0 3c0 . 9 2 ± 0 . 0 7 0 . 8 3 ± 0 . 0 4 0 . 8 9 ± 0 . 0 7 0 . 8 2 ± 0 . 0 6 5 . 1 4 ± 0 . 0 6 4 . 4 8 ± 0 . 1 7a4 . 5 0 ± 0 . 0 9 4 . 6 0 ± 0 . 1 1 4 . 7 7 ± 0 . 1 1 4 . 6 8 ± 0 . 1 2 4 . 5 2 ± 0 . 0 9 4 . 7 6 ± 0 . 1 2

3　讨　论

DCP是DM常见慢性并发症之一。其机制可能是支配膀胱的神经、逼尿肌细胞、膀胱上皮功能障碍及由ADP参与逼尿肌细胞凋亡等多因素共同作用的结果［4］。本研究采用STZ法建立DM模型10周后测的膀胱质量、膀胱容量、顺应性、膀胱内最大压力和残余尿量尿流动力学指标，与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明模型大鼠膀胱达到不稳定膀胱标准，表明DCP造模成功。该法经济简单、重复性好、成功率高，是值得推广的造模法。

DCP患者尿急、尿失禁等症状主要是由于膀胱逼尿肌收缩功能不良所致，治疗以改善逼尿肌收缩功能为主。钙离子在促进平滑肌收缩中具有核心作用，即细胞内游离钙离子升高是启动平滑肌兴奋-收缩偶联的关键，钙离子通过受体依赖性钙通道和电压依赖性钙通道进入细胞内而升高细胞质中游离钙离子水平，钙离子与钙调蛋白（calmodulin，CaM）结合，生成钙离子-CaM复合物，激活肌球蛋白轻链激酶，进而提高横桥腺苷三磷酸酶活性而促进肌肉收缩。细胞外钙离子主要通过L-型电压依赖性钙通道进入细胞内，该通道常随动作电位的发生而开放［15］。本研究应用L-型电压依赖性钙通道阻断剂——Vera后TASa增强逼尿肌的作用明显减弱，说明TASa主要通过增强L-型电压依赖性钙通道活性，促使钙离子内流而提高逼尿肌收缩能力。有研究提示，TASa也可升高胆囊和胃窦平滑肌细胞内钙离子水平而加强平滑肌的收缩［6-9］，与本研究结果一致。

G蛋白偶联受体是形成膜信号蛋白的主要组成之一，其受体结构和功能得到了充分证明，有助于进一步了解药物的作用机制。细胞膜上M受体尤其是M2、3和α1受体均属于G蛋白偶联受体，前者主要属于Gp/s，后者则主要为Gq/11，2种受体与激动剂结合后可激活G蛋白生成三磷酸肌醇与二酰甘油，进而使胞内钙离子增加，增强平滑肌收缩活动。本研究应用M受体阻断剂——Atro温育肌条后对TASa增加DCP逼尿平滑肌的收缩作用无影响，说明TASa增加DCP逼尿平滑肌的收缩作用与M受体无关。

本研究还应用Phet、Denz、Indo温育肌条后对TASa增加收缩的作用也无影响，表明TASa作用与α、H受体和前列腺素受体无关。与文献［6-9］报道的TASa加强胆囊和胃窦等平滑肌的收缩作用与M受体、H受体、壁内神经节受体、α受体和前列腺素受体可能无关的结果一致。

综上所述，本研究表明，TASa能激活平滑肌细胞膜上钙通道，升高细胞内钙离子水平，提高膀胱逼尿肌收缩功能，为许多膀胱逼尿肌功能失调性疾病的治疗提供了理论指导。TASa可增加机体对氧自由基的清除［16］，从而促进膀胱逼尿肌功能的恢复，也可结合中医辨证施治，以便找到更安全、有效、经济的改善膀胱逼尿肌功能的中药。

［1］Gomez CS，Kanagarajah P，Gousse AE.Bladder dysfunction in patients with diabetes［J］.Curr Urol Rep，2011，12（6）：419-426.

［2］蒲素.二甲双胍联合甘精胰岛素治疗晚期糖尿病肾病空腹血糖的疗效观察［J］.川北医学院学报，2015，30（1）：64-67.

［3］彭涛，何劲松，魏寿江.外科治疗2型糖尿病的主要手术方式与机制［J］.川北医学院学报，2014，29（1）：101-106.

［4］Li WJ，Shin MK，Oh SJ.Poly（ADP-ribose）polymerase is involved in the development of diabetic cystopathy via regulation of nuclear factor kappa B［J］.Urology，2011，77（5）：1265.

［5］牟新利，王武宝，巴杭，等.中药苦豆子化学成分及生理活性的研究进展［J］.新疆师范大学学报：自然科学版，2005，24（1）：45-50.

［6］牛彩琴，张团笑，买文丽.苦豆子总碱对大鼠膀胱逼尿肌作用机制的研究［J］.辽宁中医药大学学报，2013，15（1）：36-38.

［7］牛彩琴，买文丽，张团笑.苦豆子总碱对大鼠胃窦环形平滑肌作用机制的研究［J］.四川中医，2012，30（11）：55-58.

［8］苏丽梅，戴贵东，丁娟，等.苦豆子总碱对豚鼠离体胆囊平滑肌条收缩功能的影响［J］.宁夏医科大学学报，2011，33（1）：13-15.

［9］牛彩琴，买文丽，张团笑.苦豆子总碱对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦平滑肌作用机制的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2015，21（5）：151-154.

［10］陈霞，赵宏贤，徐富翠，等.Ⅰ型糖尿病胃轻瘫大鼠动物模型建立与优化［J］.四川动物，2010，29（5）：630-632.

［11］Stevens JE，Jones KL，Rayner CK，et al.Pathophysiology and pharmacotherapy of gastroparesis：current and future perspectives［J］.Expert Opin Pharmacother，2013，14（9）：1171-1186.

［12］朱宏伟，施晓会，刘红，等.糖尿病动物模型研究概述［J］.川北医学院学报，2014，29（5）：438-441.

［13］陈潮江，周兴，孔桃红，等.链脲佐菌素复制大鼠糖尿病神经源性膀胱模型［J］.中国现代医学杂志，2013，23（32）：18-21.

［14］曹石金，何朝辉，李逊，等.糖尿病大鼠膀胱结构与功能的改变［J］.广东医学，2012，33（16）：2372-2375.

［15］Zheyu C，Qinghui QI，Lixin L，et al.Effects of emodin on Ca2+signal transduction of smooth muscle cells in multiple organ dysfunction syndrome［J］. J Surg Res，2006，131（1）：80-85.

［16］李香莲，万盛华，黄敏，等.苦豆子总碱治疗大鼠溃疡性结肠炎的实验研究［J］.中国中西医结合消化杂志，2010，18（6）：366-369.

Effects of total alkaloid of sophora alopecuroids on bladder detrusor muscle activity in diabetic cystopathy rats*

Li Yan1，Sun An2，Niu Caiqin3△（1.Jingning County People′s Hospital，Pingliang，Gansu 743400，China；2.Department of Special Diagnosis，Institution Hospital of Lanzhou Military Region，Lanzhou，Gansu 730020，China；3.Department of Clinical Medicine of Integrated Chinese and Western Medicine，North Sichuan Medical College，Nanchong，Sichuan 637007，China）

ObjectiveTo observe the influence of the total alkaloid of sophora alopecuroids L（TASa）on bladder detrusor muscle activity in diabetic cystopathy（DCP）rats.Methods（1）The diabetic rat model was established by adopting streptozotocin（STZ）；（2）the urodynamic indicators were detected for establishing the DCP model；（3）the constant temperature perfusion bath tank was adopted to divide the isolated bladder detrusor muscle strips into the control group（normal muscle strip，12 samples）and DCP model group（DCP muscle strip，72 samples），then，the DCP group was subdivided into the TASa group，TASa combined verapamil group，TASa combined phentolamine group，TASa combined indometacin group and TASa combined with atropine group，12 samples in each group.The influence of TASa on the spontaneous contraction of DCP detrusor muscle was investigated. ResultsTASa could increase the contraction amplitude of bladder detrusor musclen with dose-effect dependence（r=0.89，t=3.39，P＜0.05）.The 50%effective concentration（EC50）calculated by using the linear regression method was 23.79 mg/L；but which had no influence on frequency［（4.48±0.17）times/min in DCP model group，（4.50±0.09）times/min in TASa group］，the difference was not statistically significant（P＞0.05）.Verapamil could significantly inhibit the TASa action for contracting bladder detrusor muscle，but atropine，phetolamine，benzhydramine and indomethacin had no influence.ConclusionTASa may activate calcium ion channel to increase contraction of bladder detrusor muscle.

Sophora alopecuroides；Alkaloids；Urinary bladder diseases；Diabetes complications；Urodynamics；Detrusor muscle

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.06.004

A

1009-5519（2016）06-0811-03

四川省教育厅重点项目（14ZA0182）。

李妍（1971-），主管药师，主要从事临床药理研究工作。

△，E-mail：niucaiqin@126.com。

（2015-12-02）