HER-2与Ki-67检测对直肠癌恶性程度和预后判定的价值陈丽霞

目的探讨HER-2与Ki-67检测在判定直肠癌恶性程度和预后的临床应用价值。方法选取已经确诊的127例直肠癌患者的病理切除组织及40例癌旁组织为研究对象，采用免疫组化的方法检测HER-2与Ki-67在直肠癌组织中及癌旁组织中的表达情况，并分析HER-2、Ki-67阳性表达情况与直肠癌病理特征的关系以及两者的相关性。结果HER-2与Ki-67在直肠癌中的表达阳性率均高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。HER-2在不同肿瘤分化程度、年龄、浸润深度、淋巴结转移中呈现统计学意义（P＜0.05）；在不同性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期中无统计学意义（P＞0.05）。Ki-67的表达在不同肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤大小中呈现统计学意义（P＜0.05）；HER-2、Ki-67阳性患者的无病进展期和总生存期均短于影响的患者，差异有统计学意义（P＞0.05）。在不同性别、年龄中无统计学意义（P＞0.05）。经相关性分析发现，HER-2与Ki-67在直肠癌中的表达无关联（P＞0.05）。结论HER-2与Ki-67与直肠癌的发展有密切关系，两组高表达往往预示着恶性程度高，预后差，联合检测对估算预后有重要价值。

HER-2；Ki-67；直肠癌；免疫组化；恶性程度；预后

直肠癌是消化道恶性肿瘤之一，临床表现为脓血便、便秘、腹泻等，严重危害人类的健康。虽然临床上治疗手段不断更新，但其发病率和死亡率仍居恶性肿瘤前列。肿瘤的侵袭、转移是影响患者预后的重要因素［1］。直肠癌的发生发展及预后尚不十分清楚。人类表皮生长因子受体2（HER-2）能够反映恶性肿瘤细胞增殖的情况，与多种肿瘤的发生、生物学行为和预后有关。Ki-67为敏感的细胞核增殖标志物，Ki-67抗原是反映细胞群体增殖活性的可靠指标。本研究旨在探讨HER-2与K i-67检测在判定直肠癌恶性程度和预后的临床价值，以为临床诊断和治疗提供可靠指标。

资料与方法

一、一般资料

选取我院2014年1月至2015年10月收治的127例直肠癌患者的病理标本为研究对象，纳入标准：①均确诊为原发性直肠癌，有明确的病理学诊断；②采用直肠癌根治术治疗，术前未行放化疗；③签署知情同意书；④临床资料完整；⑤癌组织及癌旁组织为经内镜活检或手术切除标本。排除标准：①急性感染、炎症性疾病；②肥胖、糖尿病；③神经系统疾病；④有凝血功能障碍者。共纳入127例直肠癌患者的病理标本，其中男69例，女58例，年龄41～85岁。

二、实验试剂

鼠抗人Ki-67、HER-2单克隆抗体及Envision即用型试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，苏木精购自福州迈新生物技术开发有限公司，无水乙醇、10%的多聚甲醛、70%的酒精溶液、80%的酒精溶液、95%的酒精溶液、二甲苯、1%伊红酒精溶液、1%盐酸乙醇溶液等购自山东大学齐鲁医院临床基础研究所。

三、方法

1.一般资料的分析

所有研究病例均由高年资病理医师对染色切片进行组织学观察和复诊，对直肠癌患者的临床及病理因素进行分析，包括年龄：≤60岁、＞60岁病理分期：参照美国国立综合癌症网络（NCCN）指南2012分期标准进行分期，入组患者均选取Ⅰ期Ⅱ期和Ⅲ期分期者；淋巴结转移情况：有淋巴结转移和无淋巴结转移；浸润深度分为：黏膜下层及肌层、全层及浆膜外；Dukes分期：分为A、B、C、D四期。肿瘤大小：肿瘤直径≤5 cm，＞5 cm；组织学分级：根据WHO分级标准将其分为高分化、中分化、低分化。生存期：PFS（无进展生存期）；OS总生存期。

2.免疫组化染色法

将所获取病理组织经4%甲醛固定48 h后，采用石蜡包埋，标本经4μm连续切片，室温放置30m in后，切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，消除内源性过氧化物酶的活性。HER-2用EDTA修复液，购自武汉博士德生物有限公司，高压加热5m in修复抗原，K i-67采用柠檬酸盐缓冲液高温加热3min修复抗原，Ki-67与抗体稀释剂以1：200混合配制，HER-2为即用型，无需配制。将配制好的Ki-67抗原及即用型HER-2滴加在切片上，4℃过夜，采用免疫组织化学Envision二步法染色，DBA显色后，显微镜下观察显色结果，苏木精复染，脱水，透明，中性树胶封固。用已知直肠癌组织阳性切片作为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。随机选择5个具有代表意义的高倍视野（×400），每个视野中计数100个细胞的阳性表达细胞数，判断表达程度。Ki-67定位于细胞核，阳性细胞染色呈现棕黄色或棕褐色。HER-2定位于细胞膜和胞浆，阳性细胞染色呈现棕黄色或棕褐色。

四、统计学处理

采用SPSS15.0进行统计学处理，计数资料以%表示，统计分析应用Fisher确切概率法，相关性分析采料用speannan等级相关检验。以P＜0.05认为差异有统计学意义。

结果

一、HER-2的表达情况

HER-2的蛋白表达位于细胞膜，在恶性肿瘤组织中表达水平较高，呈棕黄/棕褐色颗粒状，肿瘤间质均不着色，见图1。HER-2在癌旁组织表达较为微弱。40例癌旁组织中仅有1例呈现过表达，阳性率为2.5%（1/40）。在直肠癌中有69例阳性表达，阳性率为54.3%（69/127）。HER-2在直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图1　 HER-2在结直肠癌中的表达（×400）

表1　 HER-2及Ki-67在直肠癌肿瘤组织以及癌旁组织中的表达情况［n（%）］

二、Ki-67的表达情况

Ki-67为增殖指数，表达于细胞周期不同阶段，蛋白表达位于细胞膜，在恶性肿瘤组织中表达水平较高，呈棕黄色或棕褐色颗粒，反应肿瘤细胞的增殖状况，见图2。Ki-67在癌旁组织中的表达较微弱，有少数癌旁组织的腺体颈的少量细胞核染色，有10例呈现阳性表达，阳性率为25.0%（10/40）。在直肠癌中有95例阳性表达，阳性率为74.8%（95/127）。Ki-67在直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

图2　 Ki-67在结直肠癌中的表达（×400）

三、HER-2与K i-67的表达与直肠癌病理特征的关系分析

HER-2在不同肿瘤分化程度、年龄、浸润深度、淋巴结转移中呈现统计学意义（P＜0.05）；在不同性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤分期中无统计学意义（P＞0.05）。Ki-67的表达在不同肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分期中呈现统计学意义（P＜0.05）；在不同性别、年龄无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2　 HER-2与Ki-67的表达与直肠癌病理特征的关系分析

四、HER-2和Ki-67的表达与直肠癌患者生存期的关系

随访至2015年12月为止，HER-2表达阳性的患者无进展生存期、总生存期分别（4.21±1.55）月、（9.23±1.85）月，短于阴性患者的（5.35±1.52）月、（10.43±1.39）月，差异有统计学意义（P＜0.05）。Ki-67表达阳性的患者吴冰进展生存期、总生存期分别为（4.02±1.21）月、（9.12±1.77）月，短于阴性患者的（5.17±1.08）月、（10.37±1.84）月，差异有统计学意义（P＜0.05）。

五、HER-2与Ki-67在直肠癌中表达的相关性分析

经相关性分析发现，HER-2与Ki-67在直肠癌中的表达无关联（P＞0.05），见表3。

表3　 HER-2与Ki-67在直肠癌中表达的相关性分析

讨论

直肠癌是比较常见的消化系统恶性肿瘤，其发病率占到恶性肿瘤的第3位，死亡率的第5位。近年来，我国直肠癌的发病率有逐渐增加的趋势。与其他恶性肿瘤一样，直肠癌也以侵袭、转移为重要特征，这是导致患者死亡最重要的原因之一。直肠癌的发生是一个多基因参与、多步骤的复杂生物学过程，主要包括组织上皮细胞分化、增殖、存活和凋亡机制的紊乱。从分子生物学角度分析，在直肠癌多阶段发展过程中，伴随着一系列的特异和积累的遗传学改变，如原癌基因突变、激活和抑癌基因的失活。HER-2与Ki-67在肿瘤细胞增殖中起着重要作用，近年来有研究显示，HER-2与K i-67蛋白的表达程度对指导临床治疗以及估计预后有重要的检测价值［3］。

HER-2属于酪氨酸激酶Ⅰ型受体家族，是一种重要的原癌基因，定位于人类染色体区带，属于生长因子受体家族，具有络氨酸蛋白激酶活性。正常的情况下该基因处于失活状态，可检测到少量表达，可调节正常的细胞［4］。当受到某些体内外的因素刺激后，HER-2受体表达增多，具有抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤血管生成及加速肿瘤细胞侵袭力的作用［5］。HER-2癌基因在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌以及非小细胞肺癌中均有扩增或过度表达。但HER-2的表达与结肠癌的生物学行为间的研究，目前还存在分歧。有文献报道，HER-2蛋白在结直肠癌中的表达很低，与肿瘤浸润、转移、预后等无相关性。而一些文献报道，HER-2蛋白在结直肠癌中存在较高的阳性表达率，有文献报道为90%，并能反应肿瘤的浸润、分化、转移、预后等情况［6］。本研究结果显示，HER-2在直肠癌中的阳性表达率为54.3%显著高于癌旁组织。而且结果还显示，HER-2在不同肿瘤分化程度、年龄、浸润深度、淋巴结转移中呈现统计学意义；这表明HER-2的高表达往往预示着癌组织分化程度越差、浸润程度越深、侵袭性越强和转移性越强，提示预后越差对各种治疗的抵抗性越强。

Ki-67是目前应用最为广泛的标记细胞增殖活性的指标，主要定位于细胞核，其蛋白定位独特，表达在所有活动期的细胞中，是恶性肿瘤重要的参考指标之一。Ki-67蛋白质定位于细胞核内，在增殖细胞的G1、S、G2和M期表达，G0期不表达。Ki-67参与细胞周期的调控网络，而且其半衰期较短，理论上，可作为评估肿瘤细胞增殖活性、恶性潜能、预测复发最可靠的指标。有研究显示，Ki-67的表达能够可靠而迅速的反应恶性肿瘤的细胞增殖率，其表达量的高低对肿瘤的治疗及转移有着重要的临床意义［7］。相关文献报道，Ki-67在结直肠癌中的表达显著高于癌旁组织，与术后患者的存活时间呈负相关性［8］。本研究结果也证实了Ki-67在直肠癌中的表达高于癌旁组织（74.8%vs25.0%）。而且结果还显示，Ki-67的表达在不同肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤大小、肿瘤分期中呈现统计学意义。这表明Ki-67的高表达往往预示着肿瘤越大、癌组织分化程度越差、浸润程度越深、侵袭性越强和转移性越强。

本研究结果还显示，HER-2与K i-67在直肠癌中的表达在统计学上缺乏相关性，与王玉环等的研究一致［9］，但有研究发现两者在结直肠癌组织中的表达一致，有正相关性［10］。这还有待进一步研究。HER-2与K i-67对细胞的增殖有重要作用，提示可作为结直肠癌诊断的生物学参考指标。随着和直肠癌分子生物学研究的不断进展，靶向治疗已经成为直肠癌个体化治疗的重点。HER-2与K i-67在直肠癌中的表达特点为靶向治疗提供了新思路。综上所述，HER-2与Ki-67与直肠癌的发生和发展有密切关系，两组高表达往往预示着恶性程度高，预后差，联合检测能够用于判别癌的恶性程度，对估算预后有重要价值。

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［9］王玉环，王春，孙振柱.Her-2、P53和K i67在结直肠癌中的表达及意义［J］.临床荟萃，2011，26（14）：1228-1232.

［10］高超，赵晶，刘慧.HER-2与Ki-67在直肠癌组织中的表达及相关性研究［J］.放射免疫学杂志，2012，25（5）：544-546.

（本文编辑：崔晓丙）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.01.025

435002湖北省黄石市第二医院病理科

3.免疫组化的结果判定

由3位病理医生对免疫组化染色进行评价，阳染色强度按下列标准评分：无色为0分；染色弱（浅棕黄色）但明显强于阴性对照为1分；染色清晰（棕黄色）为2分；染色强（棕褐色）为3分。阳性细胞率≤25%为1分，阳性细胞率26%～50%为2分，51%～75%为2分，＞75%为3分；其中阳性细胞率＞10%视为异常表达。将以上两项得分相加，0分判为阴性（-），1～2分判为弱阳性（+），3～4分判为中度阳性（++），5～6为强阳性（+++）［2］。

（2015-11-27）