谢海坤，焦　健，樊秀彩，张　颖，姜建福，孙海生，刘崇怀

(中国农业科学院郑州果树研究所，郑州450009)



中国野生葡萄叶绿体分离及叶绿体DNA提取的研究

谢海坤，焦健，樊秀彩，张颖，姜建福，孙海生，刘崇怀*

(中国农业科学院郑州果树研究所，郑州450009)

以中国野生刺葡萄、山葡萄、桑叶葡萄和东南葡萄的成熟叶片为材料，比较柱式植物叶绿体DNAout试剂盒和改良的高盐-低pH法分离叶绿体及提取cpDNA效果。结果显示：(1)2种方法均分离得到了中国野生葡萄的叶绿体，但与柱式植物叶绿体DNAout试剂盒相比，改良的高盐-低pH法得到的叶绿体浓度高、杂质少，更适合中国野生葡萄叶绿体分离。(2)柱式植物叶绿体DNAout试剂盒提取的cpDNA，其OD260/OD280在1.28～1.36之间，质量浓度为4.2～7.8 ng·μL-1，质量低，不能满足后续测序要求；而改良的高盐-低pH法提取的cpDNA，其OD260/OD280值在1.84～1.90之间，质量浓度为2 514.4～4 133.7 ng·μL-1，质量高，纯度好，能满足后续测序要求。研究表明，改良的高盐-低pH法能简便、快速获得中国野生葡萄完整叶绿体及高质量cpDNA，并且提取的cpDNA可满足后续测序要求，为葡萄属植物叶绿体基因组的深入研究奠定了基础。

中国野生葡萄；叶绿体分离；cpDNA提取；柱式植物叶绿体DNAout；改良的高盐-低pH法

叶绿体是植物进行光合作用的重要细胞器，具有相对独立的遗传物质(cpDNA)。cpDNA一般长120 160 kb[1]，多数是共价闭合双链分子，少数为线状分子。叶绿体基因组由4部分组成，大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSC)和2个反向重复序列(IRs)。叶绿体基因组序列高度保守，且属于母系遗传，后代遗传稳定，已在遗传结构分析[2]、分子标记[3]、核质互作和叶绿体基因工程[4]、起源演化[5]等领域开展了广泛研究。

常用的植物叶绿体的分离及cpDNA提取的方法主要有DNaseI法[6]、无水法[7]、蔗糖密度梯度离心法[8]、Percoll密度梯度离心法[9]、氯化铯密度梯度离心法[10]和改良的高盐-低pH法[11]。DNaseI法难以使叶绿体膜保持完整，导致cpDNA的得率很低[11]。无水法的报道相对较少，目前只应用在C4植物黍子[12]等植物叶绿体的分离上。传统的密度梯度离心法主要用于提取豆科和禾本科植物的cpDNA，其成本高、耗时长、产率低，对设备要求也较高，不宜广泛应用[13]。而改良的高盐-低pH法，可以简单、快速获得完整叶绿体和高质量cpDNA，目前已成功在杨树[14]、雷蒙德氏棉[15]、小麦[16]、茶树[17]、枣[18]、割手密[19]等植物中得到验证。

野生葡萄叶片内富含色素和单宁类物质，在采用常规的植物叶绿体分离及cpDNA提取方法时，会产生大量泡沫或沉淀，影响分离及提取效果。1994年，吴俊辉等[20]采用蔗糖密度梯度离心法，对几种中国野生葡萄的叶绿体进行了研究，克服了色素和单宁等对叶绿体分离的影响，成功提取和纯化了叶绿体及其DNA。但是，此方法耗时长、操作繁琐、对设备要求也高，不易广泛应用。而改良的高盐-低pH法[11]结合了蔗糖密度梯度离心法、DNaseI法和盐沉淀法的优点，结果表明，它可以简便、快速地获得完整叶绿体及高质量cpDNA，已广泛应用在其他被子植物中。本研究将此方法应用于中国野生葡萄叶绿体分离及cpDNA提取，同时与柱式植物叶绿体DNAout试剂盒提取方法比较，探寻一个简便、快速获得中国野生葡萄完整叶绿体及高质量cpDNA的方法，为葡萄属植物叶绿体的分离及其DNA的提取提供方法指导，这对葡萄属植物叶绿体基因组的深入研究有重大意义。

1　材料和方法

1.1实验材料

中国野生刺葡萄(Vitisdavidii)、山葡萄(V.amurensis)、桑叶葡萄(V.heyneana)和东南葡萄(V.chunganensis)的成熟叶片采自中国农业科学院郑州果树研究所国家果树种质，郑州葡萄圃。2015年5月摘取成熟健康的葡萄叶片，带回实验室，经蒸馏水洗净，用滤纸吸干水分，并用湿润的纱布包裹。处理后的叶片于4 ℃冰箱黑暗处饥饿处理24 h，然后液氮速冻处理，存于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。

1.2方法

1.2.1叶绿体的分离和cpDNA提取柱式植物叶绿体DNAout试剂盒(CAT#: 120406-15)购自北京天恩泽基因科技有限公司，所有步骤均按照此试剂盒的使用说明书操作。

改良高盐-低pH法参考Shi等[11]的方法，略调整。所有操作均在冰上进行，所用玻璃器皿要事先预冷。

叶绿体的分离步骤如下：

(1)匀浆：取饥饿处理的中国野生葡萄叶片20 g，去粗叶脉，剪成1 cm长短，装入预冷的九阳料理机(JYL-C012)中，迅速加入预冷的Buffer A[(1.25 mol/L NaCl，0.25 mol/L抗坏血酸，10 mmol/L焦亚硫酸钠，0.012 5 mol/L 硼砂，50mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，7 mmol/L Na2EDTA(pH 8.0)，1% PVP-K40即聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，0.1%BSA即牛血清蛋白(w/v)，1 mmol/L DTT即二硫苏糖醇(BSA和DTT现用现加，pH 3.8)]400 mL，匀浆过程尽量避免发热，先低速匀浆2次，每次5 s，后高速匀浆57次，每次10 s，最终使材料匀浆完全。

(2)过滤：用200目单层尼龙网过滤匀浆液至预冷的500 mL量筒中，再等分到6个预冷的50 mL塑料离心管中，静置2 min。

(3)弃细胞残骸：4 ℃、180 g(原文献中200 g)，离心20 min，取上清；重复离心1次。

(4)粗提：4 ℃、3 070 g(原文献中3 500 g)，离心20 min，弃上清。

(5)纯化：每管沉淀中加入42 mL预冷的Buffer B[1.25 mol/L NaCl，0.012 5 mol/L硼砂，1% PVP-K40(w/v)，50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，25 mmol/L Na2EDTA (pH 8.0)，0.1%BSA(w/v)，1mmol/L DTT(BSA和DTT现用现加)，pH 8.0]，用大小适中的无菌软毛刷轻轻洗刷，使沉淀充分悬浮；4 ℃、3 070 g(原文献中3 500 g)，离心20 min，弃上清。

(6)再纯化：再次向每管沉淀中加入42 mL Buffer B，用无菌软毛刷使沉淀轻轻悬浮，4 ℃、3 300 g，离心20 min，弃上清。管中即为所得叶绿体沉淀，此步骤是新增的。

(7)重复上步操作1次。随后，用显微镜观察叶绿体的完整性。

叶绿体的裂解和cpDNA提取步骤如下：在6管纯化的叶绿体沉淀中均加入2 mL Buffer B，并合为一管，在4 ℃、3 300 g(原文献中3 750 g)，离心20 min，弃上清。再向叶绿体沉淀中加入8 mL Buffer C[100 mmol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，50 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L DTT(DTT现用现加)]、1.5 mL 20% SDS、20 μL β-巯基乙醇、30 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，充分混匀，55 ℃水浴锅中培养过夜，使叶绿体充分裂解，释放出cpDNA。

裂解结束后，将裂解液冰浴5 min，后加入1.5 mL KAc(pH 5.7)，颠倒混匀，再冰浴30 min；4℃、5 260 g(原文献中10 000 g)，离心15 min，用移液枪吸上清。加入与上清等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提2次，每次需充分颠倒混匀，4 ℃、5 260 g(原文献中10 000 g)，离心20 min。离心后的液体包括上层水相、中层变性蛋白和下层的有机溶剂。小心移取上清液至新的50 mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20 ℃过夜沉淀cpDNA。

4 ℃、5 260 g(原文献中10 000 g)，离心20 min，弃上清，得到cpDNA。用弯钩针头将沉淀挑出，置于2 mL离心管中。cpDNA用预冷的70%乙醇、无水乙醇洗涤。自然风干沉淀，加入50 μL 1×TE Buffer(pH 8.0)，4 ℃溶解过夜，轻轻混匀后，即得到cpDNA原液。

加0.5 μL RNase A(去Dnase，10 mg/mL)处理cpDNA原液，37 ℃温育30 min，自然冷却后，得到cpDNA溶液，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2叶绿体显微观察取2 mL Buffer B溶液加入提取的叶绿体沉淀中，制作临时装片，在尼康显微镜(ECLIPSE Ti-S/L100型)100×油镜下观察叶绿体的状况。

1.2.3中国野生葡萄cpDNA质量检测从提取的cpDNA溶液中取2 μL，在核酸蛋白检测仪(美国Thermo公司，ND-1000型)上测定核酸含量，用1×TE Buffer(pH 8.0)作空白对照，记录OD260/OD280、OD260/OD230及质量浓度。

1.2.4中国野生葡萄cpDNA电泳检测取2 μL cpDNA溶液，加2 μL稀释10×的荧光染料和1 μL 6×loading buffer(上样缓冲液)混匀，在0.7%(w/v)琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，恒压126 V，恒流120 mA，电泳大约60 min后，在紫外凝胶成像分析仪(Carestream公司，GL212PRO型)下检测其条带情况，并拍照。

2　结果与分析

2.1中国野生葡萄叶绿体显微观察

采用柱式植物叶绿体DNAout(方法Ⅰ)和改良高盐-低pH法(方法Ⅱ)，分别分离得到了刺葡萄、山葡萄、桑叶葡萄和东南葡萄的叶绿体(图1)。对比发现，方法Ⅱ得到的叶绿体浓度高、数量多、杂质少、背景清晰，更适宜中国野生葡萄叶绿体的分离。

2.2中国野生葡萄cpDNA质量检测

从中国野生葡萄cpDNA的OD260/OD280、OD260/OD230和质量浓度参数(表1)可以看出，2种方法得到的cpDNA各种指标差异显著。方法I提取的cpDNA质量浓度在4.2～7.8 ng·μL-1之间，OD260/OD280值在1.28～1.36之间，低于纯净DNA的比值1.8～2.0，而OD260/OD230值在0.44～0.67之间，低于污染物的评估值2.0，这表明样品中含有较多的蛋白质、酚类及多糖，cpDNA断裂严重，纯度很低，不能满足后续的建库测序要求。而方法Ⅱ提取的cpDNA，质量浓度高达2 514.4～4 133.7 ng·μL-1，OD260/OD280值在1.84～1.90之间，居纯净DNA的比值1.8～2.0之间，OD260/OD230值为在2.07～2.14之间，大于污染物的评估值2.0，说明多糖、蛋白质、碳水化合物的污染轻，可以满足建库测序要求。因此，方法Ⅱ提取的中国野生葡萄cpDNA的各种指标显著高于方法Ⅰ。由上述可知，改良的高盐-低pH方法所提取的cpDNA更能满足测序要求，此方法更适合葡萄属植物cpDNA提取。

图1　柱式植物叶绿体DNAout(Ⅰ)和改良高盐-低pH法(Ⅱ)分离几种野生葡萄叶绿体显微图片Fig. 1　Chloroplast micrographs of 4 grapes species seperated by column plant chloroplast DNAout(Ⅰ)and modified high-salt low-pH method(Ⅱ)

2.3中国野生葡萄cpDNA电泳检测

从琼脂糖凝胶电泳结果(图2)可以看出：方法I提取的cpDNA无条带，而方法Ⅱ提取的cpDNA主带清晰、明亮、整齐一致，无降解现象，且无RNA、多糖及其他次生物等杂质的干扰。对比可知，方法Ⅱ所得cpDNA的质量显著好于方法Ⅰ，与核酸蛋白检测仪分析结果相一致。

3　讨　论

高质量cpDNA是叶绿体基因组测序的基础。相对于全基因组DNA的提取，cpDNA的提取难度更大，因为叶绿体的分离较为困难，并且存在核DNA和线粒体DNA的污染。要提取高质量的cpDNA，首先要分离得到完整的叶绿体，并进行纯化。此外，叶绿体的裂解和cpDNA 的提取也需要精细操作。

表1　2种方法提取的cpDNA紫外分析结果

注：Ⅰ、Ⅱ分别对应柱式植物叶绿体DNAout和改良的高盐-低pH方法

Note: Ⅰ and Ⅱ stand for the column plant chloroplast DNAout and the modified high-salt low-pH method

图2　柱式植物叶绿体DNAout(Ⅰ)和高盐-低pH法(Ⅱ)提取几种葡萄cpDNA电泳图谱Fig. 2　Electrophoresis pattern of cpDNA of 4 grapesextracted by column plant chloroplast DNAout(Ⅰ)and modified high-salt low-pH method(Ⅱ)

目前市场上还没有针对分离葡萄叶绿体及提取其DNA的试剂盒，本实验所用的柱式植物叶绿体DNAout试剂盒主要是针对大豆、菠菜、烟草等一年生草本植物。从提取结果上看柱式植物叶绿体DNAout试剂盒不适合中国野生葡萄叶绿体的分离和cpDNA的提取，而改良的高盐-低pH法却能简便、

快速获得中国野生葡萄完整叶绿体及高质量叶绿体cpDNA。这可能是因为改良的高盐-低pH法的缓冲液中，不仅含有大量的NaCl，使细胞和叶绿体膜有充足的韧性经受离心、洗涤等操作，而且缓冲液中的维生素C、焦亚硫酸钠、BSA和DTT等还原剂能抑制溶液中的游离氧化单宁和其它次生物质呈显色反应，从而维持匀浆液最初的颜色[20]。此缓冲液还能抑制核DNA与叶绿体之间的吸附，从而减少核DNA的污染[21]。此外，采摘叶片后的黑暗饥饿处理，充分消耗了叶片中的淀粉，减少了其对叶绿体分离和cpDNA提取的干扰[18]。

本研究在改良的高盐-低pH法的基础上，对离心转速和相关步骤略微调整，成功分离出中国野生刺葡萄、山葡萄、桑叶葡萄和东南葡萄的完整叶绿体，并提取得到高质量cpDNA。改良的高盐-低pH法分离出中国野生葡萄的叶绿体及提取的cpDNA显著好于柱式植物叶绿体DNAout试剂盒所分离的叶绿体及提取的cpDNA，其OD260/OD280值在1.84～1.90之间，质量浓度为2 514.4～4 133.7 ng·μL-1，质量高，纯度好，RNA消化完全，无降解现象，能满足后续测序要求，为葡萄属植物叶绿体基因组的深入研究奠定了基础。

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(编辑:宋亚珍)

An Optimized Chloroplast Isolation and Chloroplast DNA Extraction Protocol for Chinese Wild Grapes

XIE Haikun, JIAO Jian, FAN Xiucai, ZHANG Ying, JIANG Jianfu,SUN Haisheng, LIU Chonghuai*

(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450009, China)

Mature leaves collected fromVitisdavidii,V.amurensis,V.heyneanaandV.chunganensiswere used for chloroplast isolation and cpDNA extraction in this study. The two methods were the column plant chloroplast DNAout and modified high-salt low-pH method, and the results were compared with each other. (1) Both methods had separated the chloroplast of Chinese wild grapes, but the modified high-salt low-pH method obtained higher concentration and less impurity of chloroplast than that of column plant chloroplast DNAout. So the modified high-salt low-pH method was more suitable for chloroplast isolation. (2) The value of OD260/OD280of cpDNA extracted by the column plant chloroplast DNAout was between 1.28 and 1.36, and the concentration was between 4.2 ng·μL-1and 7.8 ng·μL-1, which did not meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. In contrast, the value of OD260/OD280of cpDNA extracted by the modified high-salt low-pH method was between 1.84 and 1.90 and the concentration was between 2 514.4 ng·μL-1and 4 133.7 ng·μL-1, so the cpDNA extracted in this way was extremely high-quality and pure. As a result, the cpDNA extracted by the modified high-salt low-pH method meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. As a conclusion, the modified high-salt low-pH method isolated intact chloroplast and extract high-quality cpDNA of Chinese wild grapes simply and quickly. And the cpDNA meet the demand of subsequent chloroplast genome sequencing. It was also a critical step to make further research of chloroplast genomes ofVitisL.

Chinese wild grapes; chloroplast isolation; cpDNA extraction; column plant chloroplast DNAout; modified high-salt low-pH method

1000-4025(2016)07-1464-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.07.1464

2016-04-19;修改稿收到日期:2016-06-04

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-30-yz-1)；中国农业科学院科技创新工程专项(CAAS-ASTIP-2015-ZFRI)；农业部物种保护项目(2130135-34)

谢海坤(1989-)，女， 在读硕士生，主要从事葡萄种质资源研究。E-mail:1379226793@qq.com

刘崇怀，研究员，博士生导师，主要从事葡萄种质资源研究。E-mail: liuchonghuai@caas.cn

Q781; S663.1

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