王凤杰，王科坤，陈显兵，刘锦红，高　嵩，刘　昕

(1.湖北民族学院科技学院，恩施 445000；2.恩施州疾控中心，湖北 恩施 445000；3.湖北民族学院医学院，恩施 445000；4.附属民大医院，湖北 恩施 445000)



头顶一颗珠提取液对实验性糖尿病大鼠心肌损伤的干预作用*

王凤杰1,3，王科坤2△，陈显兵3，刘锦红4，高嵩4，刘昕4

(1.湖北民族学院科技学院，恩施 445000；2.恩施州疾控中心，湖北 恩施 445000；3.湖北民族学院医学院，恩施 445000；4.附属民大医院，湖北 恩施 445000)

目的：探讨头顶一颗珠提取液(TTM)对糖尿病大鼠心肌损伤的干预作用及机制，为进一步研究头顶一颗珠的药理作用提供理论基础。方法：雄性SPF级SD大鼠48只，随机分为4组(n=12)正常对照组、模型组、干预组、及阳性对照组，采用高脂饮食加一次性尾静脉注射STZ 35 mg/kg复制糖尿病模型。干预组在实验开始时给予TTM 浓度1 mg/ml头顶一颗珠提取液3 ml灌胃，每天1次；造模成功后阳性对照组用二甲双胍5mg/kg.d灌胃治疗，各组继续喂养6周，处死大鼠，取血测B型脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平，心脏称重计算心脏重量指数(心重/体重)，TUNEL法计算心肌细胞凋亡指数，取心室肌组织行常规形态学及Masson染色观察，检测心肌组织SOD,GPx，MDA水平。结果：TTM干预可明显降低糖尿病大鼠心脏重量，降低血清中BNP、cTnI水平，提高心肌组织中SOD,GPx活性，降低MDA含量，抑制心肌细胞凋亡，而且在增强GPx活性、抑制胶原纤维产生方面，TTM作用比西药二甲双胍效果更好。结论：头顶一颗珠提取物可能通过减轻糖尿病大鼠体内氧化应激反应，进而抑制心肌细胞凋亡，减少胶原纤维产生，来达到保护心肌细胞损伤的作用。

头顶一颗珠；糖尿病大鼠；心肌损伤；氧化应激

头顶一颗珠(trillium tschonoskii maxim,TTM)系百合科延龄草属植物延龄草的干燥根茎(俗称地珠)，是湖北恩施土家族地区的珍稀药材，被奉为“神药”，主要含有甾体皂甙、黄酮苷及倍半萜苷等有效成分[1]，具有抗癌、抗炎、提高免疫力、改善心功能和降压、降脂、清除自由基、抗衰老等功效[2,3]。关于头顶一颗珠提取物对糖尿病的作用研究很少，本课题组前期研究 发现头顶一颗珠提取液灌胃处理后，糖尿病大鼠一般情况、血糖、血脂等指标得到明显改善[4，5]，本研究进一步探讨其对糖尿病大鼠心肌损伤的干预机制，为TTM的临床应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1动物、药品与试剂

实验动物：SD大鼠，雄性，SPF级，体重150～180 g，购于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018。

药品与试剂：头顶一颗珠根状茎及根购于湖北省乐之塬科技有限公司；链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)购于美国 Sigma公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)试剂盒购于南京建成生物工程研究所；BNP、cTnI检测试剂盒购于上海邦奕生物科技有限公司；TUNEL凋亡检测试剂盒购于瑞士罗氏公司。

1.2头顶一颗珠提取液制备

取头顶一颗珠根状茎及根烘干粉碎，过60目筛，用石油醚浸泡3 h后，加热回流提取2 h，过滤，滤渣为脱脂粗粉；用75%乙醇浸泡数小时后回流提取，反复多次，将提取液滤过并减压浓缩、干燥，得总提取物；加水至总提取物全部溶解，用适量乙醚反复萃取多次，除去浓缩液中的脂溶性成分；脱脂后水饱和正丁醇萃取，减压浓缩干燥，得延龄草总皂苷，经测定药品总皂苷含量(18.54 mg/g生药材)；超纯水配成1 mg/ml溶液备用。

1.3糖尿病模型及分组

雄性SPF级SD大鼠48只，随机分为正常对照组(N，)、模型组(DM)、头顶一颗珠提取液干预组(TTM)、及二甲双胍(Metformin)治疗(Met)作为阳性对照组，每组12只，除正常对照组外，其他各组均给予高脂饲料喂养。干预组在实验开始时给予TTM 浓度1 mg/ml提取液3 ml灌胃，每天1次；正常组和模型组给予同体积饮用水灌胃。喂养4周后给予一次性尾静脉注射STZ 35 mg/kg，5 d后测空腹血糖，连续2次血糖>13.9 mmol/L，且有多饮、多食、多尿的大鼠为造模成功，用于后期实验，此时各组大鼠例数分别为N(n=12)，DM(n=10)，TTM(n=12)，Met(n=11)。二甲双胍治疗组在造模成功后用5 mg/(kg·d)灌胃，每天1次，治疗6周；其余组继续灌胃喂养6周后，处死大鼠行各项指标检测。

1.4血液生化指标检测

实验结束后立即处死取血，检测血清中BNP、cTnI水平，完整取出心脏，剪除包膜、大血管等，称重；计算心重指数。心脏体重指数(CWI)= 心脏重量(mg)/大鼠体重(g)。

1.5心肌组织SOD、GPX、MDA检测

取适量左心室肌组织，在1～4℃条件下制成100 g/L心肌组织生理盐水匀浆液，按试剂盒方法测定SOD、GPX、MDA。其中SOD采用黄嘌呤氧化酶法，MDA采用TBA法，GPx采用比色法测定。另取部分心室肌组织用10%多聚甲醛固定备用。

1.6Masson染色检测心肌组织胶原容积分数

另取部分心室肌组织用10%多聚甲醛固定，石蜡包埋后制成4 μm切片，脱蜡后苏木素染色5 min，盐酸乙醇分化，洗涤后用丽春红酸性品红溶液染色5 min，迅速水洗后再1%磷钼酸中染色3 min，又在甲苯胺蓝中染5 min后水洗烘干，树胶封片后观察。采用显微镜对所得切片观察并用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行图片分析，计算胶原纤维染色面积占观察视野面积的分数，即为胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)[6]。

1.7心肌细胞凋亡指数检测

采用TUNEL法：4%甲醛固定心肌组织，石蜡包埋，制成4 μm厚切片，每只大鼠制作10张切片，常规HE染色。按TUNEL试剂盒说明进行操作，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算凋亡指数。每个标本随机选取10个高倍视野(×400)，分别计数凋亡细胞核和正常细胞核，以凋亡细胞核与正常细胞核比值的平均值作为凋亡指数(apoptosis index，AI)[7]。

1.8统计学分析

2　结果

2.1各组大鼠一般情况观察

正常对照大鼠活泼健壮，皮毛有光泽，对外界反应灵敏，体重稳步增长；模型组注射STZ后第四天出现多汗、皮毛无光泽；随后多饮多尿、体重下降、尿液腥臊味重；干预组及阳性对照组自第二周后一般情况有所改善，皮毛光泽度渐好，多饮多食多尿情况好转，体重缓慢增加，两组大鼠一般情况无明显差别。

2.2心重指数及血清中BNP、cTnI含量情况

与正常对照组相比，糖尿病模型组大鼠血清中BNP 、cTnI水平明显升高，TTM干预后可降低血清cTnI含量(P<0.05)；TTM组及Met组大鼠血清BNP水平较DM组明显降低，但仍然高于正常组。TTM可以减轻糖尿病所致大鼠心脏重量的增加(P<0.05)，Met作用更明显(P<0.01,表1)，但TTM组和Met组无明显差别(P>0.05)。

2.3TTM对大鼠心肌组织SOD、GPX、MDA的影响

从表2中可看出，糖尿病模型组大鼠心肌SOD、GPX活性显著低于正常组，MDA高于正常组，提示大鼠心肌存在明显氧化应激反应；TTM干预后心肌组织SOD和GPX活性明显增高，MDA水平降低(P<0.05)；而Met组治疗后SOD活性显著增高(P<0.05)，MDA水平显著降低(P<0.05)，GPX活性无明显升高(P>0.05)，但TTM组和Met组无差别。

GroupnBNP(ng/L)cTnI(μɡ/L)CWI(mg/g)N12101.03±9.210.31±0.062.75±0.59DM10385.12±10.52*0.74±0.02*3.24±0.35*TTM12201.67±11.30*#0.45±0.01#2.97±0.61#Met11189.54±9.24*#0.52±0.05*#2.82±0.26##

BNP:Brain natriuretic peptide;cTnI:Cardiac troponin I;CWI:Cardiac weight index;N:Normal group;DM:Diabetes mellitus group;TTM:Trillium tschonoskii maxim group;Met:Metformin group

*P<0.05 vs N;#P<0.05，##P<0.01 vs DM

GroupnSOD(U/mg·pro)MDA(nmol/mg·pro)GPX(U/mg·pro)N1282.02±11.203.02±1.0258.21±10.23DM1052.12±9.68*3.98±0.95*41.02±9.85*TTM1278.12±9.36#3.36±1.13#55.24±8.76#Met1176.06±8.45#3.42±1.02#45.14±8.72

SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde;GPX:Glutathione peroxidase

*P<0.05 vs N;#P<0.05 vs DM

2.4各组大鼠心肌组织形态学观察

常规形态学观察可看出：正常组大鼠心肌细胞排列规则，走向好，横纹清晰，细胞间隙均匀，可见少量纤维组织；模型组心肌细胞排列紊乱，散在肌纤维变性、胞浆粗颗粒状，间质水肿、淋巴细胞浸润、纤维组织增生明显，部分肌纤维被大量条状、束状胶原纤维代替；TTM干预及Met组心肌纤维排列较模型组规则，细胞变性较轻，胶原纤维明显减少(图1见彩图页Ⅰ)。

2.5心肌组织Masson染色及细胞凋亡指数检测

Masson 染色中胶原纤维呈蓝色，正常心肌细胞呈红色。用图像处理系统测量胶原纤维阳性区所占观察视野的面积比，结果见表3。与HE染色结果一致，正常对照组心肌细胞排列整齐、致密，细胞间少有胶原纤维；模型组心肌细胞排列松散，心肌间质内及小血管旁可见较多胶原纤维分布，部分呈片状堆积；由统计结果可见TTM干预后胶原纤维量明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)；二甲双胍治疗组心肌间质内胶原纤维含量没有明显减少(P>0.05)。

与正常组相比，糖尿病模型组大鼠心肌凋亡指数明显增加，差异有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，TTM组和Met组心肌细胞凋亡率降低(P<0.05)；但是TTM干预和Met治疗均不能降低细胞凋亡至正常水平(表3)。

Tab.

CVF：Collagen volume fraction；AI：Apoptosis index

*P<0.05，**P<0.01 vs N;#P<0.05 vs DM

3　讨论

随着生活水平的提高及生活方式的改变，糖尿病的发病率呈现逐年升高的趋势，糖尿病心肌病是糖尿病的重要慢性并发症，主要病理改变为心肌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)堆积，心肌肥厚及心肌间质纤维化等，其中间质纤维化是糖尿病心肌病的重要特征，姜黄素衍生物可通过改善糖尿病大鼠糖脂代谢并减轻心肌纤维化来达到保护心肌的作用[8]。目前关于糖尿病心肌病的发生机制尚不清楚，2004年美国糖尿病学会(ADA)年会上Brownlee教授提出了糖尿病并发症氧化应激共同通路机制的学说：高糖引起线粒体中超氧阴离子生成过多，发生氧化应激，近年来多项研究结果表明抗氧化治疗可抑制糖尿病心肌损伤[9,10]。本研究证实糖尿病大鼠血清中cTnI、BNP明显增高，证明心肌细胞损伤明显；TTM干预后cTnI、BNP水平均降低，表明TTM对保护糖尿病大鼠心肌损伤、改善心功能有一定作用，因此我们试图从氧化应激方面研究头顶一颗珠对糖尿病心肌损伤的干预作用机制。

在体内高糖环境下，葡萄糖对线粒体的持续氧化可导致体内活性氧(ROS)的大量产生，氧化-还原平衡破坏，进而激活基质金属蛋白酶类，后者在心肌纤维化、心脏重塑等病理变化中扮演重要的角色[11]。实验证明，在1型和2型糖尿病心脏中均存在线粒体ROS的高表达[12]；也有学者提出减少心肌ROS的产生或加强抗氧化能力有望减轻DCM的心脏功能失常[13]。张伟[14]等研究也发现，脂联素干预后大鼠的心肌间质中胶原沉积得到明显改善，胶原容量分数显著下降，提示脂联素治疗能够达到延缓糖尿病心肌病心肌纤维化的目标。我们发现糖尿病大鼠心肌细胞肥大、胶原纤维增生，另可见小血管内膜增厚等，TTM干预后可减少间质胶原纤维产生，可能是因为头顶一颗珠提取物有效成分内含多种皂苷，降低糖尿病大鼠心肌脂质过氧化物(MDA)的产生，提高其抗氧化酶系统(SOD、GPx)的活力，通过抑制氧化应激而延缓心肌纤维化来发挥心肌损伤保护作用，但是二甲双胍无此作用；另外也可能是其提取物中含有较高微量元素硒，硒也已证实具有抗氧化作用。因此TTM提取物对于缓解糖尿病患者体内氧化应激及重要器官损伤(如心脏)所致的并发症有积极作用。

有报道[15,16]证实糖尿病氧化应激与心肌细胞凋亡密切相关，氧化应激可促进心肌细胞凋亡；糖尿病心肌病变发生与心肌细胞凋亡有关[5]，韦金儒[17]等研究证实颉沙坦可抑制心肌组织中3-硝基酪氨酸诱导的心肌细胞凋亡，但对心脏扩大无明显改善，且氧化应激是凋亡、细胞坏死和纤维化的重要途径。人参皂苷Rg1可抑制高糖所致的心肌细胞肥大[18]，可通过减少心肌细胞凋亡和抗氧化作用保护糖尿病大鼠心肌损伤[19]，我们也发现头顶一颗珠提取物可以明显减少心肌细胞凋亡，可能是其内皂苷成分通过抑制机体氧化应激而发挥抗细胞凋亡作用，但其作用途径还有待研究。

总之，氧化应激性损伤与糖尿病心肌病变的发生密切相关；鉴于临床常用药物的副作用大等特点，而中药头顶一颗珠已证实具有抗炎、抗氧化和降脂等作用，因此开发中药产品及用中药干预调理等有可能成为临床用药的参考。本研究证实头顶一颗珠可明显增强心肌内抗氧化酶活性及减轻脂质过氧化，抑制心肌细胞凋亡，减少胶原纤维沉积，从而预防或延缓心肌病变的发生，因此推测其具有抗氧化和抗细胞凋亡作用，而且通过中药干预机体氧化应激可能成为糖尿病心血管病变治疗的新方法。

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Intervention effect of trillium tschonoskii maxim extract solution on myocardial injury in diabetic rats

WANG Feng-jie1,3,WANG Ke-kun2△,CHEN Xian-bing3,LIU Jin-hong4,GAO Song4，LIU Xin4

(1.Science and Technology College of Hubei Minzu University,Enshi 445000;2.Enshi Center for Disease Control and Prevention,Enshi 445000; 3.Medical School of Hubei Minzu University,Enshi 445000;4.Pathology Department in Affiliated Hospital of Hubei Minzu University,Enshi 445000,China)

Objective:To study the protective effect and the underlying mechanism of trillium tschonoskii maxim(TTM,Traditional Chinese Medicine)on myocardial injury of diabetic rats induced by high-fat diet and streptozotocin(STZ),which will lay a theoretical foundation for further exploring its pharmacological effect.Methods:SD male rats received high fat diet and STZ(35 mg/kg)via tail vein injection were modeled into diabetic rats,the levels of brain natriuretic peptide(BNP)and cardiac troponin I(cTnI)in serum ,the contents of superoxide(SOD),glutathione peroxidase(GPX)，malondialdehyde(MDA)in cardiac tissues，and cardiac myocyte apoptosis index were tested in all groups after the last administration.Results:Compared with that in the model group,SOD and GPX activities were significantly increased and levels of BNP、cTnI、cardiac weight index(CWI)、apoptosis index(AI)were decreased in TTM and metformin(Met)group.The effects of TTM were better than traditional medicine metformin in enhancing GPX activity and decreasing collagen level.Conclusion:TTM can inhibit myocardial apoptosis by reducing oxidative stress responses in diabetic rats,which can slow down collagen fiber production to protect the myocardial cell injury.

TTM(Traditional Chinese Medicine);myocardial injury;diabetic rats;oxidative stress

湖北省教育厅科学技术研究项目(B2015112)

2015-09-14

2016-01-22

△Tel：15571851801；E-mail：625958220@qq.com

R587.1

A

1000-6834(2016)02-177-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.022