史海跃，陈慧，王华，江伟杰，胡巨伟

(宁波市妇女儿童医院生殖医学中心，宁波　315012)



·临床实践·

睾丸精子冷冻复苏对ICSI助孕结局的影响

史海跃*，陈慧，王华，江伟杰，胡巨伟

(宁波市妇女儿童医院生殖医学中心，宁波315012)

目的探讨睾丸精子冷冻复苏对ICSI助孕结局的影响。方法回顾性分析2010年1月至2014年9月因梗阻性无精子症在本院采用睾丸精子行ICSI助孕的214个周期的临床资料，其中107个周期采用冷冻复苏的睾丸精子(冻精复苏组)，另外107个周期采用新鲜睾丸精子(新鲜精子组)。比较两组中女方的一般资料、受精率、卵裂率、可利用胚胎数、优质胚胎率，以及临床妊娠率。结果本研究中，107个周期冻存睾丸精子复苏均获成功；冻精复苏组与新鲜精子组行ICSI助孕后的受精率[(76.91±18.24)% vs. (75.35±20.62)%]、卵裂率[(94.69±5.29)% vs. (95.37±4.48)%]、可利用胚胎数[(4.67±2.52) vs. (4.20±2.75)个]、优质胚胎率[(64.47±26.08)% vs. (60.34±27.39)%]及临床妊娠率(52.24% vs. 50.63%)比较均无显著性差异(P>0.05)。结论睾丸精子冷冻复苏对ICSI助孕结局并无显著影响。

睾丸精子；冷冻复苏；卵胞浆内单精子注射；妊娠结局

梗阻性无精子症是由于输精管道的梗阻使精子的运输发生障碍而产生的无精子症，在男性不育中的发生率约为1%。既往，这部分男性的生育需求基本不可能实现。直到1993年，Craft 等[1]带来了福音，首次利用睾丸精子行卵胞浆内单精子注射(ICSI)助孕获得了成功。3年后Hovatta等[2]和Gil-Salom[3]等更是将无精子症的助孕治疗向前推动了一大步，分别报道了用冻融睾丸精子行ICSI助孕获得成功妊娠。但是，睾丸精子经冷冻复苏处理后是否会影响ICSI的助孕结局尚存在争议。现将本中心近几年睾丸精子冷冻复苏后行ICSI的助孕结局总结分析如下。

一、资料与方法

1. 研究对象及分组：选取2010年1月至2014年9月在我院生殖中心因男方梗阻性无精子症行ICSI助孕者，共214个周期，其中采用冷冻复苏睾丸精子行ICSI助孕107个周期(冻精复苏组)，采用新鲜睾丸精子行ICSI助孕107个周期(新鲜精子组)。

纳入标准：第1周期行ICSI治疗、长方案超排卵、夫妇双方染色体核型分析均正常者。排除标准：女方子宫内膜异位症、子宫肌瘤、子宫畸形、卵巢功能衰竭等。

梗阻性无精子症确诊依据：至少3次射出精液离心沉淀后未见精子，诊断性睾丸活检可见成熟精子。

2. 睾丸穿刺取精：常规消毒铺巾，利多卡因局部麻醉，用带侧孔的睾丸穿刺针经皮睾丸穿刺，稍拔出针芯，挤压睾丸，再插入针芯，然后连穿刺针一起拔出，从穿刺针侧孔挑出睾丸组织，置于含10%人血清白蛋白(SSS，Irvine，美国)的人输卵管培养液(HTF，Irvine，美国)中，用2只1 ml注射器针头划破曲细精管，倒置显微镜下观察，吹打混匀后直接离心处理。

3. 精子冷冻：精子冷冻保护剂(Quinn’s，美国)置室温平衡30 min；将经处理后含有精子的悬液与精子冷冻保护剂以1∶1比例混匀，移入精子保存管进行分装，室温平衡10 min；悬吊于液氮罐内距液氮面5 cm，10 min后将精子保存管放入液氮长期保存。

4. 精子复苏：从液氮中取出保存精液的冷冻管，在室温中放置30 min；加入等量含10% SSS的HTF培养液，混匀后进行洗涤离心；最后在沉淀物中加入含10% SSS的HTF培养液混匀待用。

5. 卵母细胞获取、ICSI及胚胎移植：超促排卵均采用黄体中期启动的长方案，当直径≥20 mm的卵泡≥2个时，注射HCG 10 000 U，36 h后行阴道B超引导下穿刺取卵术。取卵后4～6 h 选取成熟卵母细胞(MII期)行ICSI操作。取卵后第3天选择最优的1～3枚胚胎移植。

6. 判断指标：正常受精：ICSI后16～17 h观察受精情况，以双原核为正常受精；卵裂率：ICSI后40～41 h观察卵裂情况，并计算卵裂球比例；优质胚胎：以卵裂球大小均匀，细胞饱满，碎片<5%的I级胚胎和碎片≤20%的Ⅱ级胚胎为优质胚胎；可利用胚胎：所有移植及冷冻的胚胎；临床妊娠：移植后14 d查血β-HCG，确定是否生化妊娠，若为阳性，2周后B超检查提示宫腔内或宫外见孕囊及胎心搏动者为临床妊娠。

二、结果

1. 冻存睾丸精子的复苏结果：107个周期冻存睾丸精子复苏均获成功，所有周期均找到了足够数量的活动精子完成ICSI。其中96个周期在行ICSI过程中较为容易地找到了足够数量的活动精子，找精时间为1～3 min/条；另11个周期因活动精子形态差或精子活力差(尾巴偶尔微微摆动)或活动精子数量少(显微镜下多个高倍视野见1～2条尾巴活动精子)而导致在行ICSI过程中找精困难，找精时间>3 min/条。

2. 两组女方一般情况比较：冻精复苏组与新鲜精子组比较，两组女方年龄、不育年限、促排卵天数(Gn天数)、促排卵药物剂量(Gn总量)均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

3. 两组胚胎发育情况及妊娠结局比较：冻精复苏组107个周期，其中取卵周期行胚胎移植67个周期，其余40个周期行全胚冷冻；新鲜精子组107个周期，取卵周期行胚胎移植79个周期，其余28个周期行全胚冷冻。两组的受精率、卵裂率、可利用胚胎数、优质胚胎率、临床妊娠率均无显著性差异(P>0.05)(表2)。

表1　两组女方一般情况比较 (x-±s)

表2　两组的胚胎发育情况及妊娠结局比较 [(x-±s)，%]

三、讨论

梗阻性无精子症给男性患者的身心均带来了极大的痛苦。近年来，这类患者能够通过睾丸或附睾穿刺抽吸术获得极少量睾丸或附睾精子，然后通过ICSI方式进行助孕。但是这些精子数量有限且来之不易，前一次手术取精成功，下一次手术取精也存在失败的风险[4]。如果将这些患者试验性睾丸穿刺或受精当天剩余精子冷冻保存，可以有效避免下个周期因为精子缺乏无法进行人工授精造成的卵母细胞浪费，为取卵当日成功受精提供了一定的保障，同时还能减少反复穿刺取精给患者带来的身体及精神上的压力和经济负担。

精子冻存的历史最早可追溯至1776年，当时就曾有专家尝试将精子冷藏于雪中[5]。由于高流动性的细胞膜以及低含水量(大约50%)等自身特点，精子似乎对发生冷冻损伤不敏感。但是，由于冻存期间的冷休克、渗透压改变、细胞内冰晶形成及氧化应激等原因[6-11]，冷冻保存会对精子的质膜、顶体、DNA完整性及其动力、活力等产生影响[12-18]，这可能导致其冷冻复苏后丧失了自身部分功能甚至是受孕能力。因此，有学者对使用冻存精子行ICSI助孕存在两点疑虑：一是精子冷冻复苏后活动率及存活率如何？二是复苏精子行ICSI助孕后结局如何？本中心对试验性睾丸穿刺后发现活动精子的患者行常规睾丸精子冷冻。经验显示只要冷冻方案及技术成熟可靠，复苏后基本能获得足够量的可利用精子。本研究复苏冻存的睾丸精子107个周期均获成功，所有周期均找到了足够数量的活动精子完成ICSI操作。Levron等[19]也认为只要取出的睾丸组织中精子数量足够，精子冷冻就可行。

同时，本研究中冻精复苏组与新鲜精子组的女方年龄、不育年限、促排卵天数(Gn天数)、促排卵药物剂量(Gn总量)比较均无显著性差异，行ICSI助孕后受精率、卵裂率、可利用胚胎数、优质胚胎率，以及临床妊娠率比较亦无显著性差异(P均>0.05)。提示睾丸精子冷冻对ICSI助孕结局并无显著影响，与之前的文献[19-22]观点一致。

综上所述，本研究结果提示睾丸精子冷冻复苏对ICSI助孕结局并无显著影响，睾丸精子冷冻保存对于梗阻性无精子症男性生育能力的保存具有积极意义。

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[编辑：郭永]

2015-12-26；

2016-03-01

史海跃，男，浙江宁海人，硕士，主治医师，泌尿外科及男科专业.(*

)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.012