曹振兰，兰晓霞，胡春秀，赵化冰

(1. 辽宁医学院，锦州　121000；2. 武警后勤学院附属医院妇产科，天津　300162；3. 天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津　300309；4. 武警后勤学院部队流行病学与统计学教研室，天津　300309)



大负荷运动对雌性大鼠雌激素及抗苗勒管激素的影响

曹振兰1，2，兰晓霞3，4 #，胡春秀2，赵化冰3*

(1. 辽宁医学院，锦州121000；2. 武警后勤学院附属医院妇产科，天津300162；3. 天津市职业与环境危害防制重点实验室，天津300309；4. 武警后勤学院部队流行病学与统计学教研室，天津300309)

目的探讨大负荷运动对卵巢功能的影响，为防治运动性月经失调，提高训练成绩提供依据。方法选择20只动情周期稳定的健康雌性SD大鼠，随机分为两组，实验组和对照组各10只，按预设方案进行跑台训练；动态观察阴道脱落细胞；监测大鼠的体重及血清雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)水平。结果随着运动负荷增加，实验组大鼠于第4周起开始出现动情周期紊乱现象；第5、6周实验组大鼠的平均体重[分别为(288.80±8.51)g、(286.70±12.95)g]显著低于对照组[分别为(305.76±7.57)g、(314.67±11.08)g](P均<0.01)；第5、6周实验组大鼠的血清E2水平[分别为(349.86±25.84)pmol/L、(332.14±27.82)pmol/L]显著低于对照组[分别为(412.80±36.81)pmol/L、(417.79±22.24)pmol/L](P均<0.01)，AMH水平[分别为(2.06±0.42)ng/ml、(1.81±0.48)ng/ml]亦显著低于对照组[分别为(2.55±0.50)ng/ml、(2.46±0.55)ng/ml](P均<0.05)。结论持续的大负荷运动会造成大鼠动情周期紊乱，血清E2和AMH水平下降，提示大负荷运动应激导致月经失调的发生机制可能与卵巢功能下降有关。

大负荷运动；动情周期；雌激素；抗苗勒管激素

【Abstract】

Objective： To investigate the effects of high intensity exercise on ovarian function，in order to provide the basis evidences for preventing exercise-induced menstrual disorders and improving training results.

Methods： Twenty healthy female SD rats with stable estrus cycle were randomly divided into two groups according to different exercise training scheme： the experimental group and control group，ten for each group. The vaginal exfoliated cells and serum levels of estrogen & anti-mullerian hormone (AMH) were dynamically observed and monitored.

Results： Along with the exercise load increased，the rats in the experimental group began to appear estrus cycle disorder from the fourth week. In the fifth and sixth week，the average weight in experimental rats [(288.80±8.51) g and (286.70±12.95) g，respectively] was significantly lower than the control group [(305.76±7.57) g and (314.67±11.08) g，respectively] (P<0.01). The serum levels of estrogen [(349.86±25.84) vs. (412.80±36.81) pmol/L and (332.14±27.82) vs. (417.79±22.24) pmol/L] were significantly lower than those in the control group (allP<0.01), and AMH [(2.06±0.42) vs. (2.55±0.50) ng/ml and (1.81±0.48) vs. (2.46±0.55) ng/ml] were also significantly lower than those in the control group (allP<0.05).

Conclusions： The present experiment results suggest that high intensity exercise can result in abnormal estrus cycle，the decrease of serum levels of estrogen and AMH in female rats，which indicates that the mechanism lead to menstrual disorder by high intensity exercise may be related to a decline in ovarian function.

(JReprodMed2016，25(8)：725-730)

大负荷运动常可导致运动性月经失调(EAMD)。资料显示，EAMD在女性耐力运动员和舞蹈演员中的发生率约为5%～20%，包括运动性闭经(AA)、月经稀疏、无排卵周期和黄体功能不全(LPD)等[1]。EAMD的发生不仅影响运动员的运动能力，其对运动员生育功能的影响也越来越受到重视。抗苗勒管激素(AMH)作为反应卵巢储备功能最早的敏感性指标[2-3]，在预测卵巢功能方面的作用已得到公众认可，但其在EAMD中的水平变化少见报道。本研究动态监测大负荷运动中大鼠血清雌激素和AMH水平的变化，为探讨EAMD的发生机制、预测EAMD患者的卵巢功能提供一定参考。

材料和方法

一、实验材料

1. 实验动物：清洁级雌性8周龄SD大鼠25只，平均体重(238.53±8.35)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK-(军)2012-0004]。参照实验动物饲养标准常规饲料喂养，每天光照12 h，自由摄水进食，室温20～25℃，相对湿度45%～55%。

2. 实验耗材和试剂：玻璃毛细管、吸管、24孔板、载玻片、1 ml注射器、EP管、试管架、记号笔、10%水合氯醛、苦味酸、生理盐水，大鼠雌激素酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、大鼠AMH ELISA试剂盒(均由上海拜沃生物科技有限公司提供)。

3. 主要实验仪器：动物跑步机(FT-200动物跑步机，成都泰盟软件有限公司提供)；微量高速离心机(TG16W，湖南长沙平凡仪器仪表有限公司提供)；酶标仪(Sunrise-Basic，TECAN，澳大利亚)；隔水式恒温培养箱(GNP-9080，苏州江东精密仪器有限公司提供)；洗板机(AC8，Thermo，美国)；显微镜(Alphaphot-2 YS2，尼康，日本)。

二、实验方法

1. 动物分组及适应性训练：实验前每天早上8：00～9：00对大鼠进行阴道涂片检查，连续观察两个动情周期，选取具有正常动情周期的大鼠进入实验。按预设方案进行适应性跑台训练1周(详见表1)，选取能适应跑台运动且有规律动情周期的大鼠20只，参照随机数字表随机分成实验组和对照组，每组10只。

表1　适应性训练方案

2. 跑台训练：本实验参照Bedford等[4]动物运动的负荷标准及王人卫等[5]大鼠动情周期抑制模型训练方案。实验组采用泰盟FT-200动物跑步机进行跑台训练，以1周为一个周期(运动6 d，休息1 d)，共训练6周，训练方案详见表2。对照组则自由活动。

3. 内眦采血：每周于第7 d，给大鼠称重，并行阴道脱落细胞学检查，尽可能于动情间期进行采血。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(3 ml/kg)，左手拇指和食指抓住大鼠颈部，轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手拇指和食指持玻璃毛细管(长约3～4 cm，内径1.0 mm)，将光滑一端于内眦部以45°角轻轻旋转刺入约4～5 mm，待有血液流入毛细管，立即提起大鼠尾部，使其处于尾高头低位，使血液自毛细管流到EP管中，一次采血1～1.5 ml，采血结束，停止压迫大鼠颈部，将其平放于试验台，拔出毛细管。血液于4℃冰箱静置30 min，3 500 rpm/min，离心20 min，取上清，-80℃保存。

表2　实验组运动训练方案

4. 阴道脱落细胞学涂片：每天早上8：00～9：00，大鼠置于试验台上，轻抚大鼠使其安静，左手拇指和食指固定尾部，其余三指轻压大鼠背部，以暴露阴道，右手持无菌吸管(吸有少量生理盐水)，轻轻旋转插入阴道内少许，轻轻吹打几次，吸出混有阴道分泌物的生理盐水，置入干净的24孔板，吹打均匀，标记。取1～2滴滴在载玻片上，显微镜下观察，根据镜下阴道涂片的细胞数量和形态来确定动情周期。随动情周期变化，阴道脱落细胞也发生变化，动情前期：细胞数量多，以有核的上皮细胞为主；动情期：大量细胞，以角化的上皮细胞为主；动情后期：可见3种形态的细胞：有核上皮细胞、无核角化的上皮细胞、白细胞，且三者数量相当；动情间期：以白细胞为主，有时少见细胞[6]。

5. ELISA法测定血清E2、AMH水平：选择处于动情间期的大鼠血清样品测定E2水平，AMH水平测定则可以选用任何动情周期的大鼠血清样品。试剂盒在室温下平衡30 min，具体实验步骤参照试剂盒说明书。

三、数据处理

结　　果

一、大负荷运动对大鼠体重的影响

随着周龄的增加，对照组大鼠体重呈逐渐上升趋势，实验组大鼠跑台训练前4周体重逐渐增加，第5周起体重呈下降趋势。实验组与对照组相比，前4周体重差异无统计学意义(P>0.05)，第5、6周实验组大鼠的平均体重[分别为(288.80±8.51)g、(286.70±12.95)g]显著低于对照组[分别为(305.76±7.57)g、(314.67±11.08)g](P均<0.01)(图1、表3)。

注：与对照组比较，**P<0.01图1　不同训练周期实验组和对照组大鼠体重变化趋势

二、大负荷运动对大鼠动情周期的影响

运动前各组大鼠均有正常动情周期，平均4～5 d，阴道脱落细胞呈规律性变化。实验组大鼠在跑台训练早期，有2只大鼠动情周期延长，分别为6 d和7 d，随后恢复正常周期。随着跑台训练的进行，于第4周开始实验组大鼠出现动情周期紊乱现象：阴道涂片观察到动情前期有核上皮细胞和动情期角化细胞逐渐减少，涂片中较少出现落叶状大片角化细胞，动情间期粘液增多，动情后期、动情间期逐渐延长。第4周实验组中有1只大鼠出现动情周期延长(达9 d)。至6周训练结束，实验组大鼠均出现了动情周期紊乱现象，其中有2只大鼠连续15 d处于动情间期。

三、大负荷运动对大鼠血清E2和AMH水平的影响

整个实验周期，对照组大鼠血清E2水平相对平稳；实验组大鼠血清E2水平随运动训练的持续呈现逐渐下降的趋势，运动训练前4周下降幅度较缓慢，第5～6周降幅显著增大，显著低于对照组(P<0.01)(图2、表3)。对照组大鼠血清AMH水平相对平稳，实验组大鼠血清AMH水平前3周较平稳，第4周起呈逐渐下降趋势，第5、6周AMH水平显著低于对照组(P<0.05)(图3、表3)。

注：与对照组比较，**P<0.01图2　不同训练周期实验组与对照组大鼠血清E2水平变化

注：与对照组比较，*P<0.05图3　不同训练周期实验组与对照组大鼠血清AMH水平变化

时间(周)体重(g)E2(pmol/L)AMH(ng/ml)对照组实验组对照组实验组对照组实验组1270.30±15.32267.07±9.64408.10±41.62442.93±46.722.48±0.772.46±0.502276.53±10.45276.54±10.89415.37±49.03430.56±38.872.52±0.702.44±0.573291.80±6.89286.58±11.25414.53±77.11407.81±38.762.48±0.572.45±0.504301.12±15.59293.32±13.02412.69±34.68401.50±26.132.59±0.562.31±0.355305.76±7.57288.80±8.51**412.80±36.81349.86±25.84**2.55±0.502.06±0.42*6314.67±11.08286.70±12.95**417.79±22.24332.14±27.82**2.46±0.551.81±0.48*

注：与同时期对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

讨　　论

一、大鼠动情周期变化

下丘脑-垂体-卵巢轴(HPO轴)维持着雌性大鼠体内雌激素的水平，大鼠的阴道上皮细胞在雌激素水平作用下，不断分裂、增生、成熟，最后角化脱落，称为动情周期。大鼠动情周期约4～5 d，可分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期。动情周期中阴道脱落细胞表现出不同的特点，因此可以通过阴道脱落细胞学检查确定大鼠所处的动情周期[6]。如果出现上皮细胞周期性变化消失、动情期角化细胞减少直至消失、正常动情周期时间延长或没有规律等，均提示大鼠发生了动情周期紊乱。

本实验中，大负荷运动实验组大鼠在跑台训练早期，有两只大鼠动情周期延长，随后恢复正常周期。这可能与大鼠的个体差异有关，开始对运动训练比较敏感，之后产生了适应性。随着运动负荷进一步增加，实验组大鼠逐渐出现动情周期紊乱现象，提示大鼠已不适应逐渐增大的运动负荷，出现动情周期的紊乱。本研究结果显示6周的大负荷运动可以导致大鼠动情周期紊乱，并且运动性动情周期的紊乱是一个渐进的过程，与以往的研究[7]相一致。有文献报道长期参与剧烈运动的女运动员EAMD的发生率显著高于正常人群[8]，这可能与大负荷运动抑制HPO轴的功能，使卵巢功能下降有关。

二、大负荷运动影响体重变化

体重下降是机体对超出机体耐受程度的运动负荷的一种反应，常用来作为判断过度训练的依据之一，也是大强度耐力运动导致运动性动情周期紊乱的表现形式之一，其下降程度与运动负荷及机体对负荷的耐受度有关。在长时间的大负荷运动中，能量消耗增加，导致体重降低。本实验中前4周的训练，随着运动负荷的增长，实验组大鼠体重呈逐渐增长趋势，且与对照组比较无显著性差异，提示大鼠对运动负荷具有一定的耐受力。自第5周起，实验组大鼠体重逐渐下降，与对照组比较开始出现显著性差异，提示训练过度，大鼠机体已不再耐受负荷运动。

三、大负荷运动对大鼠体内激素水平的影响

雌激素是由卵巢颗粒细胞及膜细胞合成并分泌的，受HPO轴的调节，其中E2生物活性最强。正常情况下，下丘脑合成促性腺激素释放激素(GnRH)，并以脉冲方式将其释放入垂体门脉系统，促进垂体分泌释放卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素(LH)，促进卵泡的发育成熟和雌、孕激素的分泌。在性成熟的雌性动物体内雌激素的合成分泌呈周期性变化，在动情期达到最高水平，在动情前期则处于最低水平。有研究显示长期运动训练的女性，常表现出低性腺类固醇激素水平，月经失调发生率较高[9]。动物实验也表明长期大负荷的运动使大鼠动情周期抑制，血清雌激素浓度下降，促性腺激素水平降低[10]。提示长期的大负荷运动可以抑制卵巢的正常分泌功能。

本实验运用ELISA方法检测大鼠动情间期血清E2水平，结果显示实验组大鼠血清E2水平随运动训练进行呈现逐渐下降的趋势，并在第5～6周降幅明显增大，显著低于对照组(P<0.01)。其原因可能是长期的大强度运动引起HPO轴功能抑制，尤其是下丘脑GnRH分泌的幅度、脉冲频率降低，抑制垂体促性腺激素的分泌，使卵巢分泌功能下降、性腺激素分泌不足[11]。

AMH是转化生长因子-β家族成员之一，主要由卵巢窦前卵泡以及小窦卵泡颗粒细胞分泌，与卵巢功能密切相关，是最新发现的评价卵巢年龄的重要指标[12-13]。有研究证实当卵巢功能和卵巢储备能力发生变化时，AMH水平改变要早于E2和孕酮(P)水平的变化；月经周期第3 d的血清AMH水平可反映出卵巢窦卵泡的数量，并且AMH水平在女性体内保持相对稳定，既不随月经周期发生变化，也不受促性腺激素的反馈调节，可准确、灵敏地评估卵巢储备功能[14-15]。目前AMH对卵巢功能评价的研究较多，但AMH在EAMD中的变化研究少见报道。

本实验结果显示，实验组大鼠血清AMH水平自第4周起逐渐下降，于第6周降至最低水平，显著低于对照组(P<0.05)，提示实验组大鼠的卵巢功能受到了影响。之前有研究显示，持续大负荷运动可导致大鼠卵泡发生闭锁，窦前卵泡和窦状卵泡数量减少[16]。郑陆等[17]研究发现，持续负荷运动可导致大鼠卵巢超微结构发生变化，卵泡基本处于较原始状态。因此，推测本实验中动情周期紊乱的实验组大鼠其卵巢结构可能也发生了变化，从而影响了卵巢功能，但这仍需进一步研究证实。

综上所述，本实验中对照组大鼠动情周期规律，体重逐渐增加，血清E2、AMH水平基本平稳，提示对照组大鼠在整个实验期间机体状态较好，性腺轴功能基本正常。而6周的大负荷运动导致了实验组大鼠的动情周期紊乱，血清E2、AMH水平显著下降，提示持续的大负荷运动应激导致月经失调的发生机制可能与HPO轴的功能异常及卵巢功能下降有关，但其具体作用机制尚有待于进一步的研究探讨。

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[编辑：辛玲]

Effects of high intensity exercise training on estrogen and anti-mullerian hormone in female rats

CAO Zhen-lan1，2，LAN Xiao-xia3，4 #，HU Chun-xiu2，ZHAO Hua-bing1，3*

1.LiaoningMedicalCollege，Jinzhou121000 2.HospitalAffiliatedLogisticsCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Tianjin300162 3.TianjinKeyLaboratoryforPreventionandControlofOccupationalandEnvironmentalHazard，Tianjin300309 4.DepartmentofEpidemiology，LogisticsCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Tianjin300309

High intensity exercise training； Estrous cycle； Estrogen； Anti-mullerian hormone

2016-01-20；

2016-03-24

武警医学院重大项目资助课题(wjz2007-4)

曹振兰，女，山东临沂人，硕士研究生，妇产科专业.(#共同第一作者；*

，Email：lanxx1995@163.com)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.011