张庆华，郝胜菊，闫有圣，胡秀琴，冯暄，梁济慈，栾桦

(甘肃省妇幼保健院，1. 医学遗传中心；2. 妇产科，兰州　730050)



复发性自然流产患者的遗传学多因素分析研究

张庆华1*，郝胜菊1，闫有圣1，胡秀琴1，冯暄1，梁济慈1，栾桦2

(甘肃省妇幼保健院，1. 医学遗传中心；2. 妇产科，兰州730050)

目的探讨复发性自然流产(RSA)发生与多种遗传学因素的相关性。方法收集928对RSA患者夫妇进行染色体核型分析，其中染色体核型为Y染色体多态性的男性进行Y染色体微缺失的多重连接探针扩增(MLPA)检测；同时对染色体核型正常的RSA女性患者进行亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFRC677T)、凝血因子Ⅴ G1691A和凝血酶原Ⅱ G20210A等遗传性易栓症相关基因多态性的测序分析。结果(1)928对RSA夫妇中，染色体异常核型的检出率为3.34%(31/928)，以染色体结构异常中的平衡易位为主(检出率2.37%)；染色体多态性核型的检出率为8.62%(80/928)，其中以Y染色体多态性为主(61.25%)；(2)49例Y染色体多态性核型的男性中，Y染色体微缺失的异常检出率高达10.20%(5/49)，以AZFc基因的微缺失和微重复为主；(3)153例染色体核型正常的RSA女性患者中，遗传性易栓症相关基因MTHFRC677T的多态性与RSA有关，且在显性及隐性遗传模式下，以隐性遗传模式的风险更高。而凝血因子Ⅴ G1691A和凝血酶原Ⅱ G20210A位点均为GG纯合基因型。结论RSA发生与染色体异常核型及多态性密切相关，尤其是其与Y染色体多态性的相关性不容忽视；另外，RSA的发生与遗传性易栓症相关基因MTHFRC677T的多态性亦有关。

复发性自然流产；染色体核型；Y染色体微缺失；遗传性易栓症基因多态性

【Abstract】

Objective： To evaluate the association between recurrent spontaneous abortion (RSA) and multiple genetic factors.

Methods： Chromosome karyotype of 928 RSA couples were analyzed. Among them，Y chromosome microdeletions of 49 male patients with Y chromosome heteromorphisms were detected by multiplex ligation-dependent probe amplification method (MLPA). Polymorphisms of hereditary thrombophilia-related genes (MTHFRC677T，factorⅤ G1691A andprothrombinⅡ G20210A) were analyzed for 153 female RSA patients with normal chromosome karyotype by sequencing.

Results： Among the 928 RSA couples，chromosomal abnormalities were detected in 3.14% of the couples (31/928) with chromosome balanced translocation as the major type (detection rate 2.4%). Chromosome heteromorphisms were detected in 8.62% of the couples (80/928)，and most of them were Y chromosome polymorphism (61.2%). Meanwhile，the frequency of abnormalities with Y microdeletion reached to 10.2% (5/49) in the 49 male patients with Y chromosome heteromorphisms，andAZFc microdeletion and microrepetition were the most frequently observed alteration. In the 153 female RSA patients with normal karyotypes，the polymorphisms ofMTHFRC677T gene maybe associated with the recurrent spontaneous abortion，and T polymorphism was one of risk factors for recurrent spontaneous abortion under recessive heredity models especially. BothfactorⅤ G1691A andprothrombinⅡ G20210A of the hereditary thrombophilia gene were GG homozygous genotype.

Conclusions： RSA is closely associated with chromosomal abnormalities and heteromorphisms，especially Y chromosome heteromorphisms. In addition，the occurrence of RSA is associated with hereditary thrombophilia related geneMTHFRC677T polymorphism.

(JReprodMed2016，25(8)：711-718)

复发性自然流产(RSA)指2次或2次以上连续发生的自然流产，是妊娠常见的并发症之一，在育龄人群中发病率约为3%～5%，约占全部妊娠的10%～15%[1]，其病因复杂，目前已知引起RSA的病因包括：遗传学因素、生殖器官解剖因素、感染性因素、免疫学因素、内分泌异常和血液供应异常等。其中，染色体异常是已知导致RSA的主要遗传学因素，在流产病因中占主导作用[2-3]。而染色体多态性，尤其Y染色体多态性及Y染色体微缺失(microdeletion)[4]，以及女性遗传性易栓症相关基因：亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T位点多态性(rs1801133)、凝血因子V G1691A位点多态性(rs6025)和凝血酶原Ⅱ G20210A位点多态性(rs1799963)等[5-6]与RSA的相关性，虽然有一些相关研究，但仍然存在争议[7-8]。

本研究主要通过对我国甘肃地区的928对RSA夫妇双方的染色体核型、Y染色体多态性及微缺失、遗传性易栓症相关基因(MTHFR、凝血因子Ⅴ及凝血酶原Ⅱ)的多态性进行分析，探讨RSA与多种遗传学因素的相关性，为RSA的遗传学病因研究以及临床遗传咨询提供参考，为RSA的早期诊断、预防和治疗提供更全面、可行的理论依据。

资料与方法

一、研究对象

收集2012年5月至2013年5月间在我院确诊为RSA的928对夫妇，其中女性患者年龄23～38岁，籍贯均为甘肃。纳入标准：女性患者均无成功妊娠史，流产次数≥2次，且流产时孕周均<20周。排除以下可能导致RSA的情况：(1)生殖道解剖异常；(2)内分泌异常；(3)生殖道感染；(4)血凝状态异常；(5)自身免疫性异常。

二、研究方法

1. 染色体核型分析：分别采集RSA夫妇双方的外周血，进行淋巴细胞培养、制片、染色体中期分裂相的核型分析；染色体分析仪采用MetaSystems染色体自动扫描分析系统(ZEISS，德国)；以人类遗传学国际命名体制(ISCN 2009)[9]为标准对染色体核型命名。

2. 多重连接依赖式探针扩增(MLPA)检测：采集、抽提RSA患者男方外周血的基因组DNA，采用荷兰MRC-Holland生物公司的P360探针MLPA试剂盒进行Y染色体微缺失检测[10]。

3. 基因测序分析：采集、抽提RSA女性患者外周血的基因组DNA，采用美国ABI公司3500基因测序仪配套设备试剂，对3种遗传性易栓症相关基因：MTHFRC677T、凝血因子Ⅴ G1691A、凝血酶原Ⅱ G20210A的多态性进行测序分析。PCR扩增方法及测序引物参考文献[11]。

三、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，样本率的比较采用χ2检验，并以相对危险度的比值比(OR)及 95%可信区间(95%CI)表示与疾病的关系。P<0.05为差异具有统计学意义。

结　　果

一、染色体核型与RSA

采用染色体核型分析技术对RSA的928对夫妇进行分析，结果如下。

1. 染色体异常核型与RSA：所有夫妇中检出染色体异常核型的31例，均为夫妇中的其中一方，占所有受检夫妇的3.34%(31/928)，其中女性异常检出17例(检出率1.83%)，男性异常检出14例(检出率1.51%)，两者的检出率比较无显著性差异(χ2=0.581，P>0.05)(表1)。同时，在异常染色体中，以染色体结构异常中的平衡易位居多，共22例(检出率2.37%)，占染色体异常核型总数的70.97%(22/31)，包括相互易位14例、罗氏易位7例和1例较少见的复杂易位(表1)。通过χ2检验分析发现，染色体平衡易位与RSA的OR值为6.891，95%CI：2.668-17.798(P<0.001)，提示染色体平衡易位为RSA的重要风险因素。其他类型的染色体异常还包括：染色体倒位(12.90%)、染色体重复(3.23%)及染色体数目异常(12.90%)(表1)。

表1　31例异常染色体核型情况

注：*XX/XY：女性/男性，即女性3例，男性1例

2. 染色体多态性核型与RSA：所有夫妇中检出80对夫妇中的其中一方为染色体多态性，占所有受检夫妇的8.62%(80/928)(表2)，其中男性检出率为7.33%(68/928)显著高于女性的检出率1.29%(12/928)(χ2=0.784；P<0.05);其中以Y染色体异染色质变异(Yqh±)为主，占多态染色体的61.25%(49/80)。其他染色体多态性还包括：9号染色体臂间倒位(7.50%)、D/G组染色体随体区变异(18.75%)、1，9，16号染色体次缢痕增加(1/9/16 qh+)(12.50%)(表2)。

二、Y染色体微缺失与Y染色体多态性及RSA

采用MLPA技术，结合P360探针试剂盒，对染色体核型为Y染色体多态性的49例男性进行Y染色体AZF基因(a、b、c区)的微缺失检测，共检出5例异常，主要集中在AZFC区域，包括：AZFC部分缺失(3例)、AZFC部分重复(1例)、AZFC部分缺失部分重复(1例)(图1)。

三、遗传性易栓症相关基因多态性与RSA

采用测序法对随机抽取的染色体核型正常的RSA女性患者(153例，病例组)进行遗传性易栓症相关基因(MTHFRrs1801133、凝血因子Ⅴ rs6025和凝血酶原Ⅱ rs1799963)的多态性分析，同时与前期研究[11]的100例正常生育妇女(正常对照组)进行相应的3个基因位点多态性比较，结果如下。

1.MTHFR基因C677T多态性与RSA：经计算本研究纳入的正常对照组及病例组人群基因型频数分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=0.551，P>0.05)，具有群体代表性。MTHFR基因C677T存在CC、CT和TT等3种基因型。根据显性遗传模式，MTHFR基因C677T的T多态与RSA的OR=1.638，P<0.05；而根据隐性遗传模式，其与RSA的OR=2.495，P<0.001，提示MTHFR基因C677T的T多态与RSA相关，且在隐性遗传模式中的风险相对更高(表3)。

2. 凝血因子Ⅴ G1691A和凝血酶原Ⅱ G20210A基因多态性与RSA：凝血因子Ⅴ rs6025和凝血酶原Ⅱ rs1799963位点，均为GG纯合基因型，未检测到其他基因型(表3)。

表2　80例多态染色体核型

注：*XX/XY：女性例数/男性例数

表3　遗传性易栓症3个相关基因多态位点与RSA的关联性分析

A：AZFC基因部分缺失；B：AZFC基因部分重复；C：AZFC基因部分缺失部分重复图1　Y染色体微缺失的MLPA检测

讨　　论

一、染色体核型与RSA密切相关

1. 染色体异常核型：染色体异常是目前相对明确的引起RSA的遗传学因素，其在RSA夫妇中的发生率高达2%～8%[12]，而在正常对照人群中的发生率仅为0.2%。所以，对RSA夫妇进行染色体核型分析是进一步诊治前的检查项目之一[13]。本研究对RSA夫妇进行染色体核型分析以明确病因，并根据双方染色体核型结果，对下次的妊娠风险进行遗传咨询及评估指导。

本研究的928对RSA夫妇中，检出染色体核型异常31对，均以夫妇中的1方为主。染色体异常的检出率为3.14%，这与其它研究报道2%～8%的检出率[12，14-15]相近。染色体核型异常中，以结构异常多见，主要为染色体平衡易位，本研究所纳入的研究对象中染色体平衡易位共22例，与RSA的OR高达6.891，提示其是RSA的重要风险因素。这可能是由于平衡易位携带者，虽然没有发生重要基因的丢失或扩增，表型正常，但是其在妊娠的减数分裂过程中，会导致非平衡性染色体核型的配子产生，进而导致反复流产等不良妊娠结局[16]。本研究通过对RSA患者进行染色体核型分析发现平衡易位携带者后，进而根据不同类型的染色体平衡易位结果，分类进行了遗传风险的评估及指导：(1)14例相互易位，通常其在妊娠过程中有1/18的机率出生正常小孩和1/18的机率出生染色体平衡易位小孩，其余16/18的机率均易发生流产等不良妊娠结局。(2)6例非同源染色体罗氏易位，通常其在妊娠过程中有1/6的机率出生正常小孩和1/6的机率出生罗氏易位小孩，其余4/6的机率均易发生流产等不良妊娠结局，但是，当其为涉及有第21号染色体的罗氏易位时，因具有生育易位型21-三体患儿的风险，一定要在妊娠过程中做好产前诊断工作以避免21-三体患儿的出生。(3)同源罗氏易位携带者，通常其妊娠后代中，多为流产或者出生易位型三体的患儿，建议此类携带者不要生育，或接受赠精或赠卵[17]；但本研究中检出的同源罗氏易位携带者核型为嵌合体：46，XX/45，XX，der(15；15) (q10；q10)，尚有出生正常孩子的机率。本研究亦发现其他类型的染色体结构异常，如4例染色体倒位，这类染色体倒位携带者通常在妊娠过程中有1/4的机率出生正常小孩和1/4的机率出生染色体平衡易位小孩，其余2/4的机率均易发生流产等不良妊娠结局[18]。

对于RSA夫妇染色体异常的性别差异，以往的研究认为RSA夫妇的染色体异常有明显性别差异，女性中的发生率较男性要高[19]。但本研究结果中RSA夫妇中的染色体异常并无男女性差异。因此，在临床遗传咨询建议中，RSA夫妇必须双方共同进行染色体检查以明确病因；后续根据染色体异常的类型，有针对性地进行相应的胚胎植入前诊断(PGD)及产前诊断，以减少流产及染色体异常胎儿出生等的机率[20]，积极预防流产及出生缺陷。

2. 染色体多态性：传统观点认为它属于正常变异，不会产生临床效应，但现在越来越多的研究发现，染色体多态性与生殖方面的异常相关，可引起自然流产、胚胎停育等，自然流产患者中染色体多态性的发生率要高于普通人群[21-24]。本研究结果中RSA夫妇染色体多态性的检出率为8.62%，与国内其他研究结果[21-23]基本一致，并且比Akba等[24]学者研究发现的8.4%亦略高，提示染色体多态性可能与RSA有密切关系。故而，在复发性流产患者的遗传学病因分析中不应忽视染色体多态性的作用。

同时，本研究还发现RSA夫妇染色体多态性有性别差异，男性染色体多态性的检出率高于女性，以Y染色体多态性为主，占多态染色体的61.25%(49/80)，提示Y染色体多态性可能与复发性流产存在密切关系。

二、Y染色体多态性多可能由AZFc基因的缺失和重复所造成

Y染色体的多态性主要是由其长臂远段异染色质部分的长度差异(Yqh±)造成的，该区Y染色体特有的串联重复序列DNA的重复、缺失、易位或螺旋化程度的改变均可引起长度的变异；从而影响相关精子分化和发育的基因正常表达。通常，在细胞水平进行常规染色体核型分析，发现Y染色体多态性时，临床工作中常无法判断Y染色体是否在分子水平存在相关重要基因的缺失。因此，近年有学者建议对有流产史的Y染色体的多态性男性进行Y染色体微缺失检测，以明确Y染色体上携带的重要基因有否缺失[23]。

AZF基因定位于Y染色体长臂上的Yq11，是与精子发生及性腺发育相关的主要基因。这一区域主要分为AZFa、AZFb和AZFc区，这3个区分别主导精子形成过程中的不同阶段。目前研究发现，Y染色体AZF基因的微缺失多与男性不育明确相关，是导致男性生精障碍主要的遗传学因素之一[25-26]；而其与RSA的相关研究较少，结论尚不一致[4，27-29]。本研究对49例男性行AZF基因微缺失分析，结果发现AZF基因多发生微缺失微重复，且以AZFC区为主，其检出率高达10.20%(5/49)，这为Y染色体多态性分子机制的阐述奠定了一定的分子生物学实验基础，提示Y染色体多态性可能多由AZFc基因的微缺失微重复所造成。但尚不能确定Y染色体微缺失是否与RSA相关，后续将扩大标本量进行相关性分析，以进一步明确两者之间可能存在的相关性。

三、遗传性易栓症相关MTHFR基因C677T的多态性可能与RSA相关

遗传性易栓症相关基因，包括MTHFRC677T、凝血因子Ⅴ G1691A和凝血酶原Ⅱ G20210A等，这类基因发生突变，可造成持续高凝及血栓形成倾向，从而导致自然流产。在不同地域及人群，其与RSA的相关性存在差异[6-10]。

本研究中对3个遗传性易栓症相关基因的多态性位点进行基因测序分析，结果发现凝血因子Ⅴ G1691A位点和凝血酶原Ⅱ G20210A位点在我国妇女中均为GG纯合基因型，未检测到其他基因型，这虽与国外的研究结果[6-8]不同，但与国内现有的研究结果[9]比较一致，提示其对我国妇女RSA的发病可能并未造成影响。而MTHFR基因C677T的多态性则可能与RSA具有相关性，且MTHFR基因T多态可能是我国甘肃省RSA女性患者的遗传危险因素之一，其增加了RSA发生的风险；在显性、隐性遗传模式下，隐性遗传模式的风险更高。同时，MTHFR作为叶酸和甲硫氨酸-同型半胱氨酸代谢循环中的关键酶，在其MTHFR基因第4外显子的第677位核苷酸由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)时，丙氨酸转变成缬氨酸，导致MTHFR的酶活性降低。MTHFR677的CT杂合子患者该酶活性下降35%，而MTHFR677的CT纯合子患者该酶的活性则下降达70%，该酶活性的下降直接导致其产物甲基四氢叶酸浓度的降低，继而破坏机体凝血与纤溶之间的平衡，导致自然流产的发生[30]。本研究结果为MTHFRC677T基因型进行易感基因的筛选和个体化甲基四氢叶酸的干预、治疗，提供了重要的分子生物学理论依据。

综上，本研究对RSA患者相关的遗传学多因素进行了细胞遗传学及分子遗传学的综合分析，以期进一步明确RSA患者相关的遗传学病因，为临床开展有针对性的遗传风险评估、植入前诊断及产前诊断提供基础；为防治RSA，尤其是为甘肃省RSA人群的积极防治奠定了基础。

[1]Branch DW，Gibson M，Silver RM. Clinical practice.Recurrent miscarriage[J]. N Engl J Med，2010，363：1740-1747.

[2]Suzumori N，Sugiura-Ogasawara M. Genetic factors as a cause of miscarriage[J]. Curr Med Chem，2010，17： 3431-3437.

[3]Dutta UR，Rajitha P，Pidugu VK，et al. Cytogenetic abnormalities in 1162 couples with recurrent miscarriages in southern region of India： report and review[J]. J Assist Reprod Genet，2011，28：145-149.

[4]Soleimanian S，Kalantar SM，Sheikhha MH，et al. Association between Y-chromosome AZFc region micro-deletions with recurrent miscarriage[J]. Iran J Reprod Med，2013，11：431-444.

[5]Sharma A，Bhakuni T，Ranjan R，et al. Polymorphisms in factor V and antithrombin III gene in recurrent pregnancy loss： a case-control study in Indian population[J]. J Thromb Thrombolysis，2015，39：481-488.

[6]徐俐，刘肖曼，张红岩，等. 亚甲基四氢叶酸还原酶、凝血因子V和凝血酶原基因多态性与原因不明复发性早期流产的关系[J]. 中华妇产科杂志，2007，42：180-183.

[8]Dutra CG，Fraga LR，Nácul AP，et al. Lack of association between thrombophilic gene variants and recurrent pregnancy loss[J]. Hum Fertil (Camb)，2014，17：99-105.

[9]郝胜菊，梁济慈，郑雷. 兰州地区6665例遗传咨询患者外周血淋巴细胞染色体核型分析[J]. 中国优生与遗传杂志，2012，20：40-42.

[10]江雨，王文博，郭奇伟，等. 多重连接探针在无精子症和严重少精子症患者AZF微缺失检测中的应用[J].中华男科学杂志，2012，18：115-121.

[11]张庆华，郝胜菊，刘青，等. 甘肃地区复发性自然流产与遗传性易栓症相关基因突变的关系研究[J]. 中国优生与遗传杂志，2015，23：27-29.

[12]Ghazaey S，Keify F，Mirzaei F，et al. Chromosomal analysis of couples with repeated spontaneous abortions in northeastern iran[J]. Int J Fertil Steril，2015，9：47-54.

[13]郎景和. 妇产科遗传学[M]. 北京： 人民卫生出版社，2005：99-100.

[14]胡亮，李浩贤，彭莹，等. 1770对自然流产夫妇的细胞遗传学回顾性分析[J]. 国际生殖健康/计划生育杂志，2014，33：168-171.

[15]夏冰，叶长烂，周霞，等. 广州地区自然流产夫妇染色体异常核型三十年回顾分析[J]. 中国优生与遗传杂志，2014，22：35-36.

[16]张璘，任梅宏，宋桂宁，等. 染色体易位携带者核型分析与妊娠结局研究[J]. 中国优生与遗传杂志，2014，22：37-40.

[17]赵晓，孙晓纲，沈国民，等. 中国人群罗伯逊易位携带者的核型分布与生育情况分析[J]. 中国妇幼保健，2011，26：1672-1676.

[18]吴玥丽，许雅娟. 染色体结构异常携带者的产前诊断与遗传研究[J]. 中国妇幼保健，2014，29：3941-3943.

[19]付祝能，何云芹，钱惠英，等. 浙江部分地区2889例遗传咨询者细胞遗传学检查分析[J]. 中国优生与遗传杂志，2006，14：33-34.

[20]范俊梅，李娜，刘忠宇，等. 应用基因组杂交、单核苷酸芯片及二代测序技术开展植入前染色体异常诊断[J]. 中国实用妇科与产科杂志，2014，30：565-570.

[21]李冰琳，刘力，王党利，等. 624对复发性流产夫妇细胞遗传学分析[J]. 中华围产医学，2008，11：49-50.

[22]李亚丽，高健，余小平，等. 复发性流产与染色体相关性研究[J]. 中国妇幼保健，2013，28：3615-3618.

[23]刘念，阎炯，宋婕萍，等. 染色体多态性与复发性流产的关系研究[J]. 实用妇产科杂志，2015，31：75-77.

[25]Elfateh F，Rulin D，Xin Y，et al. Prevalence and patterns of Y chromosome microdeletion in infertile men with azoospermia and oligzoospermia in Northeast China[J]. Iran J Reprod Med，2014，12：383-388.

[26]卢丹洁，罗招云，林芬，等. Y染色体微缺失检测在男性不育的临床应用[J]. 分子诊断与治疗杂志，2014，6：228-232.

[27]Karaer A，Karaer K，Ozaksit G，et al. Y chromosome azoospermia factor region microdeletions and recurrent pregnancy loss[J]. Am J Obstet Gynecol，2008，199：662-665.

[28]慕明涛，霍满鹏，刘俊俊，等. 习惯性流产与Y染色体微缺失关系的研究[J]. 中国妇幼保健，2011，26：4404-4405.

[29]Wettasinghe TK，Jayasekara RW，Dissanayake VH. Y chromosome microdeletions are not associated with spontaneous recurrent pregnancy loss in a Sinhalese population in Sri Lanka[J]. Hum Reprod，2010，25：3152-3156.

[30]Zetterberg H. Methylenetetrahydrofolate reductase and transcobalamin genetic polymorphisms in human spontaneous abortion： biological and clinical implications[J]. Reprod Biol Endocrinol，2004，2：7.

[编辑：辛玲]

Multiple genetic factors analysis in patients with recurrent spontaneous abortion

ZHANG Qing-hua1*，HAO Sheng-ju1，YAN You-sheng1，HU Xiu-qin1，FENG Xuan1，LIANG Ji-ci1，LUAN Hua2

1.MedicalGeneticCenterofGansuProvincialMaternityandChild-careHospital，Lanzhou730050 2.ObstetricsandGynecologyDepartmentofGansuProvincialMaternityandChild-careHospital，Lanzhou730050

Recurrent spontaneous abortion；Chromosomal karyotype；Y chromosome microdeletion；Polymorphism of hereditary thrombophilia gene

2015-08-05；

2016-01-11

甘肃省自然基金资助项目(1107RJZA108)

张庆华，女，甘肃兰州人，主治医师，医学遗传学专业.(*

，Email：0929zhangqh@163.com)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.009