胡丽梅　秦淑芬　姜保慧　张英　焦晓坤



葛根素联合门冬胰岛素对妊娠期糖尿病患者TLR4/NF-κB炎症信号通路及脂肪因子的影响

胡丽梅秦淑芬姜保慧张英焦晓坤

目的观察葛根素联合门冬胰岛素对妊娠期糖尿病(GDM)患者外周血单核细胞Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)炎症信号通路及脂肪因子的影响。方法选取2013年6月至2015年12月诊治的GDM患者100例，随机分为对照组和观察组，每组50例。对照组给予门冬胰岛素治疗，观察组在对照组基础上加用葛根素注射液治疗。比较2组外周血单核细胞(PBMC)TLR4、NF-κB、IκB mRNA和蛋白表达及血清白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C-反应蛋白(CRP)、网膜素(chemerin)、脂联素(APN)、内脂素(visfatin)变化。结果2组治疗后TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达、IL-6、IL-12、TNF-α、CRP、visfatin水平较治疗前显著降低，IκB mRNA和蛋白表达、chemerin、APN水平较治疗前显著升高(P<0.05)，但观察组以上指标改善程度优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论葛根素联合门冬胰岛素能够明显抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路活化引起的炎性因子的释放，并调控脂肪因子分泌。

葛根素；门冬胰岛素；糖尿病，妊娠；Toll样受体 4；核因子-κB；脂肪因子

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是产科常见病，是指妊娠期间首次确诊的糖耐量异常疾病，该病易导致羊水过多、酮症酸中毒、巨大儿、新生儿呼吸窘迫综合征，且母体远期糖尿病发病率明显增加[1,2]。目前，我国GDM发病率约4.3%～5.1%，且呈逐年上升趋势，严重威胁母婴健康[3]。然而，GDM发病机制尚不清楚。大多数学者认为，GDM发病机制与Ⅱ型糖尿病相似，胰岛素抵抗导致高胰岛素血症和(或)胰岛β细胞功能障碍是GDM发病的主要病理机制，其中细胞因子介导的炎症反应是胰岛素抵抗形成的重要因素。研究表明，Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)炎症信号通路活化导致机体出现的异常炎症反应在2型糖尿病发生、发展中发挥关键作用，是2型糖尿病、动脉粥样硬化、心肌缺血/再灌注损伤等炎症性疾病的重要病理基础[4]。近年来研究发现，脂肪因子与胰岛素抵抗密切相关，可能在GDM发病过程中发挥重要作用[5]。本研究观察了葛根素联合门冬胰岛素对GDM患者外周血单核细胞(PBMC)TLR4/NF-κB炎症信号通路及脂肪因子的影响，为阐明GDM的发病机制及葛根素的治疗机制提供理论依据。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2013年6月至2015年12月我院收治的GDM患者100例为研究对象。纳入标准：(1)符合GDM诊断标准[6]：孕妇空腹血糖(FBG)、口服后1 h、2 h血糖值分别为5.1、10.0和8.5 mmol/L；(2)均为单胎妊娠；(3)孕前体重指数(BMI)22～26 kg/m2；(4)依从性好，且签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他产科疾病；(2)严重心、肝、肺、肾等重要脏器功能障碍者；(3)孕前糖耐量异常者；(4)对降糖药物过敏者。100例患者随机分为对照组和观察组，每组50例。对照组年龄22～38岁，平均(29.87±4.25)岁；孕次(2.02±0.33)次；孕前BMI(24.99±3.02)kg/m2；孕周28～38周，平均(36.31±2.15)周；初产妇31例，经产妇19例；观察组年龄23～39岁，平均(30.42±4.48)岁；孕次(2.11±0.40)次；孕前BMI(24.87±3.00)kg/m2；孕周26～38周，平均(36.13±2.12)周；初产妇30例，经产妇20例。2组年龄、孕次、孕前BMI等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。

组别年龄(岁)孕次(次)孕前BMI(kg/m2)孕周(周)孕产状况[例(%)]初产妇经产妇对照组29.87±4.252.02±0.3324.99±3.0236.31±2.1531(62.00)19(38.00)观察组30.42±4.482.11±0.4024.87±3.0036.13±2.1230(60.00)20(40.00)

1.2试剂与仪器RPMI-1640培养基、胎牛血清、小鼠抗人TLR4、NF-κB、IκB抗体购自美国Santa Cruz 公司；Ficoll淋巴细胞分离液、细胞裂解液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒购自日本Takara公司；Trizol、实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司。Chemi DocTM XRS+化学发光凝胶成像系统购自美国Biorad公司)。7300型Real time-PCR扩增仪购自美国ABI公司。

1.3治疗方法2组治疗期间均给予健康宣教、控制饮食、适当锻炼等常规治疗。对照组在常规治疗基础上每日晚餐前皮下注射门冬胰岛素，初始剂量0.2～0.3 U·kg-1·d-1，根据血糖变化增减2 U。观察组在对照组基础上加用葛根素注射液，200～400 mg加入500 ml 0.9%氯化钠溶液中，1次/d。2组均用药至分娩。

1.4观察指标观察2组TLR4、NF-κB、IκB mRNA和蛋白表达、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、C反应蛋白(CRP)、网膜素(chemerin)、脂联素(APN)、内脂素(visfatin)变化。

1.5实验方法

1.5.1PBMC的分离和培养:采集患者清晨空腹静脉血15 ml，静置30 min，Ficoll淋巴细胞分离液分离PBMC，洗涤提纯后胎盘蓝染色鉴定细胞活力。将细胞接种于24孔板，加入含10%胎牛血清，1 ml/100 ml青、链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下常规培养。

1.5.2Real time-PCR:Trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，ABI 7300型荧光定量PCR仪扩增。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得到各样本、各基因扩增的Ct值，以β-actin为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2-ΔΔCt。见表2。

表2　Real time-PCR引物序列及扩增产物长度

1.5.3Western-blot:提取细胞总蛋白，半干法电泳转移至PVDF膜，10%脱脂奶粉封闭2 h。依次加入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，化学发光法显色、定影。用UVP软件扫描测定蛋白条带IOD值，β-actin作为内参照，以目的蛋白与β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.5.4ELISA:采集患者空腹静脉血2 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血清，-80℃保存。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清hs-CRP、IL-6、TNF-α、chemerin、APN、visfatin水平。试剂盒购自南京建成生物工程公司，严格按照试剂盒说明书操作。

2　结果

2.12组TLR4、NF-κB、IκB mRNA和蛋白表达比较2组治疗前TLR4、NF-κB、IκB mRNA和蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；2组治疗后TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达较治疗前有所下降，IκB mRNA和蛋白表达较治疗前有所升高，差异有统计学意义(P<0.05)，但观察组改善程度优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、4。

组别TLR4mRNANF-κBmRNAIκBmRNA对照组 治疗前1.77±0.211.69±0.210.47±0.06 治疗后1.01±0.15*0.98±0.11*1.13±0.14*观察组 治疗前1.80±0.241.65±0.200.45±0.05 治疗后0.43±0.07*#0.37±0.05*#1.69±0.23*#

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

组别TLR4蛋白NF-κB蛋白IκB蛋白对照组 治疗前1.68±0.201.58±0.170.39±0.05 治疗后0.92±0.13*0.87±0.10*1.01±0.13*观察组 治疗前1.70±0.231.60±0.200.38±0.06 治疗后0.35±0.05*#0.26±0.04*#1.57±0.21*#

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

2.22组炎性因子水平比较2组治疗前IL-6、IL-12、TNF-α、CRP水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组治疗后IL-6、IL-12、TNF-α、CRP水平较治疗前有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)，但观察组下降程度优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

组别IL-6(pg/ml)IL-12(pg/ml)TNF-α(pg/ml)CRP(μg/ml)对照组 治疗前186.43±15.1577.44±8.2026.78±3.226.56±0.78 治疗后142.24±10.40*60.12±5.48*19.36±2.79*4.99±0.53*观察组 治疗前190.21±18.0375.97±8.2328.02±3.476.70±0.81 治疗后98.67±9.23*#42.23±5.16*#13.14±2.05*#3.12±0.34*#

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

2.32组脂肪因子水平比较2组治疗前chemerin、APN、visfatin水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组治疗后chemerin、APN水平较治疗前有所升高，visfatin水平较治疗前有所下降，差异有统计学意义(P<0.05)，但观察组改善程度优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

组别chemerin(ng/L)APN(mg/L)visfatin(ng/L)对照组 治疗前47.56±5.284.29±0.4518.23±2.47 治疗后59.17±6.45*9.21±1.13*13.21±1.67*观察组 治疗前48.22±5.134.23±0.4319.10±2.58 治疗后78.34±7.87*#15.65±2.22*#7.34±0.89*#

注：与治疗前比较,*P<0.05;与对照组比较,#P<0.05

3　讨论

TLR4是TLRs家族的重要成员，主要表达在单核细胞、中性粒细胞等免疫细胞上，在其介导的炎症信号通路中发挥“闸门”作用。MyD88是TLR4炎症信号通路的下游效应分子，通过一系列信号级联反应导致NF-κB的激活和核转位，从而诱导IL-6、IL-12、TNF-α、CRP等炎症相关基因转录。IL-6是T淋巴细胞、单核巨噬细胞分泌的细胞因子，在机体免疫炎症反应、胰岛素抵抗形成中发挥重要作用[7]。IL-12是一种多功能细胞因子，能够调节细胞免疫活性，并诱导NK细胞、T淋巴细胞产生干扰素，后者与其他细胞因子协同作用共同导致胰岛β细胞功能障碍及胰岛素抵抗[8]。TNF-α是单核巨噬细胞产生的促炎因子，通过诱导胰岛β细胞表达一氧化氮合酶(NOS)促使NOS、NO生成增多，从而抑制胰岛素作用[9]。CRP是反映非特异性炎症反应的敏感指标。多项研究表明，CRP与胰岛素抵抗及糖尿病发生、发展密切相关，可作为GDM的早期预测因子[10]。Xie等[11]研究表明，GDM患者外周血PBMC中TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达及炎症因子水平显著上调，提示TLR4/NF-κB炎症信号通路的激活是GDM发病的关键。

脂肪组织还是一个重要的内分泌器官，分泌chemerin、APN、visfatin等多种脂肪因子，可调节脂肪组织和其它组织的功能，参与胰岛素信号转导及糖脂代谢等多个生理过程，在肥胖、胰岛素抵抗及2型糖尿病发病机制中发挥重要作用。Chemerin是白色脂肪细胞分泌的细胞因子，通过增强胰岛素信号、促进葡萄糖摄取和利用调节胰岛素敏感性[12]。研究表明，chemerin是与肥胖关系最密切的脂肪因子，其水平与BMI、空腹血糖、空腹胰岛素、三酰甘油呈负相关，在胰岛素抵抗、糖脂代谢过程中发挥重要作用[13]。APN是脂肪细胞分泌的生物活性因子，具有抗炎、抗动脉粥样硬化、增强胰岛素敏感性等作用。秦卫胜等[14]研究表明，GDM患者血清ANP水平显著降低，与胰岛素抵抗发生密切相关。Visfatin是与糖脂代谢有关的蛋白质细胞因子。Esteghamati等[15]研究表明，GDM患者血清visfatin水平显著升高，与血糖水平呈正相关，提示visfatin可能在GDM发生、发展中发挥重要作用。以上研究结果表明，脂肪因子可能参与了GDM患者糖脂代谢及胰岛素抵抗形成过程，可作为GDM患者胰岛素抵抗的标志物，脂肪因子可能成为治疗GDM的新靶点及预测患者预后的指标。

本研究通过分析葛根素联合门冬胰岛素对GDM患者外周血PBMC中TLR4/NF-κB炎症信号通路及脂肪因子的影响，结果显示，2组治疗后TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达、IL-6、IL-12、TNF-α、CRP、visfatin水平较治疗前显著降低，IκB mRNA和蛋白表达、chemerin、APN水平较治疗前显著升高(P<0.05)，但观察组以上指标改善程度优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明葛根素联合门冬胰岛素治疗GDM能够明显抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路活化引起的炎症因子的释放，并调控脂肪因子分泌。

综上所述，葛根素联合门冬胰岛素治疗GDM疗效显著，在抗炎、调控脂肪因子分泌方面优于单纯西药治疗。本研究表明葛根素联合门冬胰岛素在GDM治疗中具有广阔的应用前景。

1王凤环，李华萍. 妊娠期糖尿病患者胰岛素抵抗及胰岛素分泌功能的评估.上海交通大学学报(医学版)，2015，35：364-368.

2贾晓炜，赵鑫，张颖，等. 妊娠期糖尿病患者饮食自我管理与个体化干预研究. 重庆医学，2015，44：327-328.

3Simeoni U, Barker DJ. Ofspring of diabetic pregnancy: long-term outcomes. Semin Fetal Neonatal Med，2009,14:119-124.

4Den Dekker WK, Cheng C, Pasterkamp G, et al. Toll like receptor 4 in atherosclerosis and plaque destabilization. Atherosclerosis,2010,209: 314-320.

5初晓丽，李雪莲. 脂肪细胞因子与妊娠期糖尿病. 中国优生与遗传杂志，2015，23：138-140.

6李雪姣，陈淑琴，祁珮，等. 基于IADPSG新诊断标准的妊娠期糖尿病筛查结果分析. 山东医药，2014：65-67.

7van Poppel MN, Peinhaupt M, Eekhoff ME, et al. Physical activity in overweight and obese pregnant women is associated with higher levels of pro-inflammatory cytokines, and with reduced insulin response through Interleukin-6. Diabetes Care,2014,37: 1132-1139.

8刘爱红，解梅林，王磊，等. 妊娠期糖尿病患者白介素12的测定及其临床意义. 中国妇产科临床杂志，2013，14：171-173.

9Salmi AA, Zaki NM, Zakaria R, et al. Arterial stiffness, inflammatory and pro-atherogenic markers in gestational diabetes mellitus. Vasa,2012,41: 96-104.

10刘陶，房臻，杨冬，等. 炎性及脂肪细胞因子与妊娠期糖尿病发病的相关性及在产褥期的变化. 中华妇产科杂志，2012，47：436-439.

11Xie BG，Jin S，Zhu WJ. Expression of toll-like receptor 4 in maternal monocytes of patients with gestational diabetes mellitus. Exp Ther Med,2014,7: 236-240.

12Takahashi M, Takahashi Y, Takahashi K, et al. Chemerin enhances insulin signaling and potentiates insulin-stimulated glucose uptakein 3T3-L1 adipocytes. J FEBS Lett,2008,582: 573-578.

13Sell H, Laurencikiene J, Taube A, et al. Chemerin is a novel adipocyte-derived factor inducing insulin resistance in primary human skeletal muscle cells. J Diabetes,2009,58: 2731-2740.

14秦卫胜，杨文东. 脂肪细胞因子与妊娠期糖尿病相关性研究. 中华临床医师杂志(电子版)，2012，6：1324-1325.

15Esteghamati A, Alamdari A, Zandich A,et al. Visfatin is associated with type 2 diabetes mellitus independent of insulin resistance and obesity. Diabetes Res Clin Pract,2011,91: 154-158.

Effects of puerarin combined with insulin aspart on TLR4/NF-κB inflammatory signal pathway and adipokine in pregnant women with gestational diabetes mellitus

HULimei*,QINShufen,JIANGBaohui*,etal.

*TheSecongDepartmentofObstetrics,HospitalforMaternalandChildHealth,Hebei,Zhangjiakou075000,China

ObjectiveTo observe the effects of puerarin combined with insulin aspart on plasma monocyte Toll-like receptors 4/nuclear factor kappa B (TLR4/NF-κB) inflammatory signal pathway and adipokine in pregnant women with gestational diabetes mellitus (GDM).MethodsA total of 100 patients with GDM who were admitted and treated in our hospital from June 2013 to December 2015 were randomly divided into observation group (n=50) and control group (n=50).The patients in control group were treated by insulin aspart,however,the patients in observation group were treated by puerarin combined with insulin aspart. After treatment, the expression levels of TLR4, NF-κB and IκB mRNA and protein, interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), C reactive protein (CRP), chemerin, adiponectin (APN) and visfatin were detected and compared between two groups.ResultsAfter the treatment, the expression levels of TLR4 and NF-κB mRNA and protein, IL-6, IL-12, TNF-α, CRP and visfatin in observation group were significantly decreased in both groups,as comapred with those before treatment,but the expression levels of IκB mRNA and protein, chemerin and APN in both groups were significantly increased,as compared with those before treatment (P<0.05). However the improvement degree of the indexes mentioned above in observation group was superior to that in control group (P<0.05). ConclusionThe puerarin combined with insulin aspart in treatment of GDM can obviously inhibit the release of inflammatory factors by regulating the activation of TLR4/NF-κB inflammatory signal pathway and modulating the secretion of adipocytokines.

puerarin;insulin aspart; gestational diabetes mellitus; Toll-like receptors 4; nuclear factor kappa B; adipokine

075000河北省张家口市妇幼保健院产二科(胡丽梅、姜保慧、张英、焦晓坤)，妇一科(秦淑芬)

R 714.147

A

1002-7386(2016)16-2443-04

2016-03-12)

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.16.012

项目来源：河北省中医药管理局科研计划项目(编号:2016157)