王萍　张熊



miRNA-223,-99a检测在儿童急性白血病中的临床应用

王萍张熊

目的探讨骨髓微小RNA(MicroRNA，miRNA)-223、-99a检测在儿童急性白血病(AL)中的临床应用。方法收集30例急性白血病患儿的骨髓染色及临床资料，分为复发组(n=13)和缓解组(n=17)，另选取健康体检儿童8例作为对照组，采用实时荧光定量PCR(Realtime-PCR，RT-PCR)技术检测儿童骨髓miR-223和 miR-99a的表达。比较分析以上两标志物在儿童急性白血病疾病中的变化。结果复发组和缓解组miR-223和 miR-99a表达与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；复发组miR-223和 miR-99a表达与缓解组比较差异有统计学意义(P<0.01)。复发组和缓解组miR-223和 miR-99a表达呈负相关(r值分别为-0.529、-0.587，P<0.01)。结论骨髓miR-223和 miR-99a表达与儿童急性白血病的病变发展有关，其可作为儿童急性白血病诊断和治疗的分子标志物。

儿童急性白血病；完全缓解；复发；miR-223；miR-99a

急性白血病是血液系统的恶性肿瘤，随着化疗技术的进展，完全缓解(CR)率越来越高，但急性白血病缓解患者的复发仍然是患者长期生存的主要威胁[1]。儿童与成人白血病存在生物学特性、治疗反应、治愈率以及造血系统肿瘤类型等方面的不同[2，3]。近年来有研究发现，miRNA在细胞的增殖、分化和凋亡等多种生理过程中发挥重要作用，而且其异常表达可能促进肿瘤的发生，与白血病的发生发展、治疗反应和预后有密切联系[4-9]。miRNA分子遗传学异常已成为近年白血病的研究热点。本研究采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术对30例白血病患儿骨髓miR-223、 miR-99a的表达进行检测，探讨两标志物与儿童白血病的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2011年3月至2015年3月在我院住院的急性白血病骨髓标本30例, 其中男17例，女13例;年龄2～13岁，平均(6.7±1.9)岁。其中急性淋巴细胞白血病(ALL)19例，急性非淋巴细胞白血病(ANLL)11例。30例患儿中复发AL(复发组)13例，完全缓解(缓解组)17例。另选取选8例健康体检的正常骨髓作为对照组，其中男5例，女3例;年龄3～12岁，平均(6.2±1.7)岁。急性期出现低热、乏力和面色苍白者15例，占88.2%，皮肤再现瘀点、瘀斑者3例，占17.6%，出现骨痛者2例。ANLL用DA(正定霉素、阿糖胞昔)方案诱导缓解。ALL用VDCLPL(长春新碱、正定霉素、环磷酰胺、左旋门冬酰胺酶、强的松)方案诱导缓解。均经1个疗程完全缓解。本组已持续缓解1～12个月，平均4．5月，所有样本经骨髓细胞形态学诊断(按FAB分型)证实；缓解组患儿诊断标准为患儿白血病的症状和体征消失，白细胞分类中无白血病细胞，骨髓中原粒细胞≤5%，M3型原粒细胞+早幼粒细胞≤5%，无Auer小体，红系和巨核细胞系正常[10]。本研究经本院伦理委员会批准，且所有研究对象的家长签署知情同意书。

1．2方法

1．2．1标本采集:完全缓解期患者骨髓标本均为强化前采。复发病例均为化疗前采集，所有受试对象抽取骨髓0.5 ml，肝素抗凝，加Trizol裂解液充分裂解后冻存于-80℃冰箱备用。

1．2．2总RNA抽提及逆转录:Trizol法提取总RNA，取Trizol裂解液加焦碳酸二乙酰(DEPC)水调整至4 g/L，置于冰盒备用。按照美国应用生物系统(ABI)公司逆转录试剂盒说明书提供的操作步骤进行操作，采用ABI 9700PCR反应仪逆转录合成miR-223和miR-99a特定的cDNA。逆转录反应条件设置为：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存。miR-99a引物序列，正义链： 5’-CGTAGCATCCTTAGAACTCAGC-3’；反义链： 5’-CCGCTCGAGGAACTATTGTTGAACGGCACT-3’。miRNA-223引物序列，正义链：5’-AAAAGTTAACCCCAGAGCAATAAGCCACATTA-3’,反义链：5’-AAAAACTCGA GCAGGGACAGCCTTCTTCTTG-3’。β-actin作为内参照，引物序列为：正义链5‘-ACCATGGATGATGATATCGCC-3’,反义链5’-GCCTTGCACATGCCGG-3’,miRNA-223,-99a表达量用Ct值变化表示。△Ct(HVCT)-(Xn)Ct，Ct(HVCT)是对照组Ct的平均值，(Xn)Ct表示病例组Ct平均值。急性白血病患儿与对照样本的miRNA的相对表达量为2-Δct。

2　结果

2.1急性白血病临床表现和三系细胞结果比较复发组的WBC、Hb和BPC分别与缓解组和对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)；缓解组的三项指标与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2miRNA-223,-99a表达水平比较复发组miRNA-223,-99a表达量分别与缓解组和对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01), 缓解组miRNA-223,-99a表达量与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表13组WBC、Hb和BPC结果比较

组别WBCHbBPC对照组(n=8)6.71±2.35132±9.7153±31.0缓解组(n=17)6.83±1.69123±10.3149±29.7复发组(n=13)15.97±9.77*#56±15.7*#45±36.2*#

注：与对照组比较，*P<0.05；与缓解组比较，#P<0.05

组别miRNA-223miRNA-99对照组(n=8)0.93±0.170.21±0.06缓解组(n=13)0.89±0.190.23±0.05复发组(n=17)0.15±0.05*#0.97±0.19*#

注：与对照组比较，*P<0.05；与缓解组比较，#P<0.05

2.3相关性分析复发组和缓解组miRNA-223,-99a表达量呈负相关(r=-0.529,-0.587,P<0.01)。在两病例组中，miRNA-223,-99a的表达分别和WBC 、Hb和BPC具有相关性(r值分别为-0.477,0.426,0.437，0.463,-0.413,-0.429，P<0.01)。

3　讨论

许多研究显示，在不同的生物条件下(包括不同的肿瘤或同一肿瘤在不同的发病年龄)，某些miRNAs的生物作用截然不同[11-16]。miR-99a在不同的肿瘤中可能呈现不同的生物作用。有报道认为miR-99a在舌上皮细胞癌和非侵袭性膀胱上皮癌的初发患者中存在高表达，推测其可能起原癌基因的作[17,18]；而在肺癌初发患者中却低表达，推测其可能发挥抑癌基因的作用[19]。miR-99a在小儿与成人白血病中存在不同的表达谱。现已证实有许多小儿与成人白血病在生物学特性、治疗反应、治愈率以及造血系统恶性肿瘤类型等方面有明显不同，有报道认为miR-99a在小儿与成人急性髓性白血病(AML)中存在明显差异的表达谱[20]。且初发ALL miRNA表达谱的改变可以作为判断儿童ALL预后的指标[21]。本研究通过RT-PCR技术检测30例急性白血病患儿骨髓miR-99a的表达结果显示复发组miR-99a的表达明显高于缓解组和对照组，提示复发患者的骨髓造血功能可能受到抑制，机体的免疫状态可能趋于恶化。而缓解组与对照组miR-99a的表达无差异进一步印证了急性白血病的治疗效果。白血病的发生和发展是一个错综复杂的过程，本研究显示了miR-99a在儿童急性白血病中的表达水平，其更深层次的作用还需进一步研究，而且与白血病相关的其他更多miRNAs以及它们之间的相互作用关系也期待发掘和阐明。

有研究收集31例接受瓣膜置换术的风心病患者的心房肌组织，采用时荧光定量聚合酶链反应分析其miR-223的表达水平发现，房颤组和窦性心律组miR-223的表达呈现显著差异[22]。另外的研究采用PCR技术分析42 例急性白血病患者的骨髓miR-223表达，发现miR-223在AML、ALL中的表达水平均低于正常对照组，而miR-223在 AML中的表达水平明显高于 ALL[23]。Mi等[24]报道在AML和ALL中表达差异最显著的四个miRNA是miR-128a、miR-128b、let-7b和miR-223，而其中任意两个miRNAs都可以准确有效地区分97%～100%的ALL和AML患者。有研究采用基因芯片技术检测儿童ALL初发-缓解配对的骨髓样本中miRNA的表达显示，初发ALL患儿miR-223和miR-27a表达降低，而在缓解期患儿中升高[25]。本研究结果认为miR-223在急性白血病患儿骨髓中存在低表达，而在缓解组出现表达上升。miR-223在复发组的低表达反应了白血病患儿的病情状况，提示了白血病细胞的生长可能没有得到足够的抑制。其在缓解期的较高表达印证了白血病缓解治疗的效果。进一步显示了miR-223作为诊断和治疗小儿白血病而存在的潜在前景。其有可能用作白血病诊断和治疗的分子标志物。

复发组和缓解组miRNA-223,-99a表达量呈负相关(P<0.01)。两标志物表达分别与WBC 、Hb和BPC具有相关性，推测两标志物的异常表达与儿童急性白血病的病理变化有关，进一步显示miRNA-223,-99a表达可能在小儿急性白血病的诊断和治疗中发挥重要作用，联合检测两标志物可作为儿童急性白血病诊断和治疗的分子标志物，为完全缓解患者免疫治疗提供依据，以期增加急性白血病患者的长期生存率。 综上所述，miR-223、miR-99a的表达与急性白血病关系密切相关，检测miRNA-223,-99a的表达，与患者临床疗效和长期生存有着直接关系， 对治疗的选择和调整具有重要的意义。因此，miRNA-223,-99a有可能作为急性白血病诊断和治疗的新标记物，通过分析miRNAs 的表达谱及其不同组合的表达将会是未来急性白血病诊断和治疗的新方法。

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The clinical significance of detection of miR-223 and miR-99a in children with acute myeloid leukemia

WANGPing*,ZHANGXiong.

*DepartmentofPediatrics,TheFirstPeople’sHospitalofXianyangCity,Shan’xi,Xianyang712000,China

ObjectiveTo investigate the clinical significance of the detection of marrow MicroRNA (miR-223 and miR-99a) in children with acute myeloid leukemia.MethodsThe marrow staining specimens and clinical data aboult 30 children with acute myeloid leukemia were collected and were divided into relapse group (n=13) and remission group (n=17),moreover,8 healthy children were served as control group.The expression levels of miR-223和 miR-99a in marrow were detected by Real-time fluorescent quantitative PCR (Real time - PCR,RT-PCR),furthermore, the changes of the two markers in children with acute myeloid leukemia were observed and compared among the three groups.ResultsThere were significant differences in the expression levels of miR-223 and miR-99a between relapse group and control group as well as between remission group and control group (P<0.01). Moreover there were significant differences in the expression levels of miR-223 and miR-99a between relapse group and remission group (P<0.01). Besides the expression levels of miR-223 and miR-99a in relapse group were negatively correlated to those in remission group (r=-0.529,-0.587,respectively,P<0.01).ConclutionThe expressions of miR-223 and miR-99a in bone marrow are correlated with the pathogenesis and development of acute myeloid leukemia in children,thus,which can be regarded as molecular markers in diagnosis and treatment of acute myeloid leukemia in children.

acute leukemia in children; complete remission; relapse; miR-223；miR-99a

712000陕西省咸阳市第一人民医院儿科(王萍),检验科(张熊)

R 733.71

A

1002-7386(2016)16-2416-03

2016-01-13)

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.16.004