张海天 王国祥 尹荣 邱满堂 许林

长非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）广泛参与了各种生理和疾病过程，在肺癌的发生和进展过程中也发挥着重要的调控作用[1,2]。MALAT1是肺癌中最早被鉴定的lncRNA之一，也是肺癌研究领域中研究最多的lncRNA之一，很多研究都证实MALAT1可以促进肺癌的恶性进展[3-5]。

MALAT1在肺癌中的分子机制目前已有相关报道，但是对MALAT1与微小RNA（microRNA, miRNA）的相互调控关系的研究尚少[6,7]。此外目前关于MALAT1与miRNA的研究多是集中在miRNA对MALAT1表达的负性调控[7]，而MALAT1对miRNA表达的调控作用尚未见系统性研究。因此，本研究旨在通过实验和生物信息手段，系统性地研究MALAT1调控的miRNA。

1 材料与方法

1.1 实验材料 A549细胞购买于中国科学院上海细胞库，H1640培养基购于南京凯基公司，RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒和实时定量PCR试剂盒购于Takara公司，TaqMan Low Density Array（TLDA）芯片购于AppliedBiosystems公司，转染试剂Lipo2000购于Invitrogen公司。实验所用引物和反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides,ASO）于南京金斯瑞公司合成，MAL AT1引物序列：上游5’-GGATCCTAGACCAGCATGCC-3’，下游5’-AAAGGTTACCATAAGTAAGTTCCAGAAAA-3’；β-肌动蛋白引物序列上游：5’-GAAATCGTGCGTGACATTAA-3’，下游：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’。ASO序列：ASO1：5’-ATGGAGGTATGACATATAAT-3’，ASO2：5’-TCTTATGTTTCCGAACCGTT-3’[3,4]。

1.2 细胞培养与转染 A549细胞培养在10%FBS的H1640培养基中，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养。将A549细胞接种于六孔板中转染，使用Lipo2000试剂以终浓度100 nmol/L转染ASO[4,8]。RT-PCR法检测MALAT1表达：A549细胞转染24 h后使用Trizol法提取总RNA，根据试剂盒说明进行逆转录反应。RT-PCR反应体系：cDNA 0.5 μL、水3.7 μL、上下游引物各0.4 μL、2×reaction mix 5 μL，使用ABI 7900仪器进行RT-PCR反应，每组实验均以β-actin作为内参[9,10]。

1.3 TaqMan Low Density Array（TLDA）实验 A549细胞转染后提取总RNA并逆转录，使用ABI 7900仪器根据制造商说明书进行TLDA芯实验，使用制造商提供的RQ manage软件进行数据分析。

1.4 基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA） 将差异表达基因按照差异倍数从高到低排序，使用GSEA软件中的GseaPreranked选项进行数据分析，miRNA基因集注释文件下载自GSEA网站[11]。……