梁达炜，梁权辉，方艳平，姜长宏，龙　军，曾念宜，林丽娟，江凌晓



基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速鉴定沙门菌临床分离株

梁达炜，梁权辉，方艳平，姜长宏，龙军，曾念宜，林丽娟，江凌晓

目的评估基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在沙门菌鉴定中的临床应用，并研究其影响因素。方法用传统血清学方法鉴定沙门菌的血清型，用MALDI-TOF MS对哥伦比亚血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板分别培养24 h、72 h、120 h和168 h的179株沙门菌进行鉴定。结果179株沙门菌可分为38种血清型，肠炎沙门菌(21.2%)、斯坦利沙门菌(17.3%)和Ⅰ4,5,12:i:-沙门菌(16.2%)居前3位。所有菌株在血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板分别培养24 h和72 h均能被MALDI-TOF MS准确鉴定为沙门菌。MALDI-TOF MS的耗材成本约为微生物自动生化鉴定系统(Vitek 2)的1/3，检测时间约为Vitek 2的1/7。结论在血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板培养3 d以内的沙门菌，MALDI-TOF MS均可以准确鉴定。与Vitek 2相比，MALDI-TOF MS检测的速度更快，消耗的成本更低，并且可以直接鉴定生长在选择性培养基的沙门菌。

沙门菌；基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；鉴定

Supported by grant of the National Projects of Major Infectious Disease Control and Prevention (No. 2012ZX10004-213)

从1966年到2007年，世界上每年有超过9 380万人患上沙门氏菌病，导致155 000个死亡病例[1]。基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time f Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) 是近年发展起来的一种新型软电离质谱技术，并逐渐应用于细菌和真菌的快速鉴定[2-4]。MALDI-TOF MS的基本原理是微生物标本与基质形成的共结晶体被激光照射后，通过基质吸收激光能量传递给样本，同时将质子转移给生物分子，从而使其发生电离，不同的微生物标本产生不同的微生物蛋白质量指纹图谱而被鉴别。目前常用的微生物自动生化鉴定系统，例如Vitek 2(梅里埃，法国)，是通过辨别细菌引起的不同生化反应进行菌属鉴定，但其细菌培养的时间和生化反应的时间使检测时间至少需要4 h。不同的培养基、培养时间、样品的处理方式会影响MADLI-TOF MS鉴定细菌的结果[5-6]。本研究利用MADLI-TOF MS检测179株沙门菌的临床分离株，评估其在沙门菌鉴定中的临床应用，并对其影响因素进行研究。

1　材料与方法

1.1菌株来源本研究中，共有179个沙门菌菌株，由南方医科大学珠江医院微生物实验室保存。所有细菌菌株均经过Vitke 2 (梅里埃, 法国)鉴定为沙门菌菌属。

1.2仪器微生物自动生化鉴定系统Vitek 2和MALDI-TOF MS 质谱仪为法国梅里埃公司产品。

1.3试剂GN卡(革兰阴性菌鉴定卡)、CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)基质液、Vitek MS-DS 靶板、MH平板、哥伦比亚血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板均为法国梅里埃公司产品。沙门菌诊断血清为丹麦国家血清研究院(Statens Serum Institut, Denmark)产品。

1.4血清型鉴定沙门菌菌株血清型鉴定参考国家标准GB4789.4-2010进行，根据Kauffman-White 表，确定具体的血清型。

1.5MALDI-TOF MS鉴定所有的菌株接种于哥伦比亚血平板37 ℃孵育(24±1) h。用无菌接种环挑取单个菌落均匀涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL CHCA覆盖，在室温下自然干燥后进行检测。每个菌株从靶板点样到质谱检测重复2次试验。

1.6不同培养条件下MALDI-TOF MS对沙门菌的鉴定179株沙门菌菌株分别接种于血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板，在37 ℃分别培养24 h、72 h、120 h、168 h后挑取单个菌落均匀涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL CHCA覆盖，在室温下自然干燥后进行检测。每个菌株从靶板点样到质谱检测重复2次试验。

2　结　果

2.1血清型分布179株沙门菌被鉴定为38种血清型，其中肠炎沙门菌38株，占21.2%；斯坦利沙门菌31株，占17.3%；，Ⅰ4,5,12:i:-沙门菌29株，占16.2%；鼠伤寒沙门菌18株，占10.1%；德尔卑沙门菌6株，占3.4%；汤卜逊沙门菌5株，占2.8%；韦太夫雷登沙门菌5株，占2.8%；其他血清型沙门菌47株，占26.3%。

2.2MALDI-TOF MS和Vitek 2鉴定沙门菌的比较MALDI-TOF MS对肠炎沙门菌、I 4,5,12:i:-沙门菌、鼠伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌等38种血清型179株沙门菌均能准确鉴定，与Vitek 2 鉴定的结果完全一致，如表1所示。Vitek 2鉴定沙门菌的耗材成本远高于MALDI-TOF MS，几乎是MALDI-TOF MS的3倍，如表2所示。另外，MALDI-TOF MS每鉴定16株沙门菌所需要的时间仅仅约为Vitek 2所需时间的1/7。

在临床微生物检测的工作中，怀疑沙门菌感染的临床患者的标本需要先用选择性平板如SS平板、HE平板进行培养，然后对可疑的菌株需转接到血平板再培养18～24 h后，挑取单个菌落，用Vitek 2进行检测。另外，单个菌株从上机检测至结果输出，Vitek 2至少需要4 h。因此，Vitek 2鉴定沙门菌从标本接种至鉴定结果输出至少需要2 d，而MALDI-TOF MS可以直接从SS平板、HE平板挑取菌落进行鉴定，只需1 d左右就能获得鉴定结果，并且单个菌株上机检测的过程仅需要5 min。

2.3不同条件下MALDI-TOF MS鉴定沙门菌的结果接种于4种不同类型的平板：血平板、HE平板、SS平板、麦康凯平板的179株沙门菌分别培养24 h和72 h均能被MALDI-TOF MS准确鉴定为沙门菌，如表3所示。培养时间为120 h时，血平板、HE平板、SS平板、麦康凯平板培养的沙门菌菌株分别有7株、8株、36株、32株无法与质谱仪的数据库匹配得出检测结果，故其被MALDI-TOF MS成功检测的鉴定率分别为96.1%、95.5%、79.9%和82.1%。然而，当培养时间为168 h时，血平板、HE平板、SS平板、麦康凯平板培养的沙门菌菌株分别有88株、89株、96株、61株无法与质谱仪的数据库匹配得出鉴定结果，故其被MALDI-TOF MS成功检测的鉴定率分别为50.8%、50.3%、46.4%和65.9%。

表1MALDI-TOF MS 和Vitek 2对不同血清型沙门菌在属的水平上的鉴定结果比较

Tab.1Comparison of MALDI-TOF MS and Vitek 2 for Salmonella identification at genus level

血清型Serotype菌株数No.ofisolatesMALDI-TOFMSno.ofisolates(%)Vitek2no.ofisolates(%)准确鉴定Correctidentification鉴定错误Wrongidentification未鉴定出No.ofnotdetected准确鉴定Correctidentification鉴定错误Wrongidentification未鉴定出No.ofnotdetected肠 炎沙门菌3838(100.0)0038(100.0)00斯坦利沙门菌3131(100.0)0031(100.0)00I4,5,12:i:-沙门菌2929(100.0)0029(100.0)00鼠伤寒沙门菌1818(100.0)0018(100.0)00德尔卑沙门菌66(100.0)006(100.0)00其他33种血清型5757(100.0)0057(100.0)00合计179179(100.0)00179(100.0)00

表2MALDI-TOF MS 和Vitek 2鉴定沙门菌的耗材成本和时间

Tab.2Consuming cost and detection time of MALDI-TOF MS and Vitek 2 for Salmonella identification

MALDI-TOFMSVitek2Consumingcost(yuan)/oneisolate2056Detectiontime(min)/16isolates45320

a从菌株标本准备到结果结果输出所需时间。

Note: Detection time from isolate preparation to result output.

表3MALDI-TOF MS在不同培养基不同培养时间条件下对179株沙门菌准确鉴定的菌株数量和鉴定率

Tab.3Number of Salmonella isolates and identification rate for accurate identification of 179 Salmonella strains by MALDI-TOF MS under different culture mediums and inoculation time

培养时间Inoculationtime(h)培养基Culturemedium血平板BloodagarHE平板HEagarSS平板SSagar麦康凯平板MacConkeyagar24179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)72179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)120172(96.1%)171(95.5%)143(79.9%)147(82.1%)16891(50.8%)90(50.3%)83(46.4%)118(65.9%)

3　讨　论

从上世纪80年代以来，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)被发现可以对大质量生物分子进行分析，包括核糖体蛋白，MALDI-TOF MS就逐渐被广泛应用于细菌的检测[7]。随后，国内外多个研究报道，不同的培养基和不同的培养时间对MALDI-TOF MS鉴定微生物的结果产生影响[5, 8-10]。但是，对于从临床患者分离的沙门菌菌株，目前还没有研究报道不同种类的培养基和不同培养时间对MADLI-TOF MS的鉴定结果的影响。

本研究中，对于在血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板分别培养24 h和72 h的179株沙门菌临床分离株，MALDI-TOF MS均能准确鉴定到沙门菌菌属。但是当培养时间延长至120 h时，部分菌株无法被MALDI-TOF MS准确鉴定；当培养时间延长至168 h时，在各种类型平板培养的菌株至少有35%的菌株无法被MALDI-TOF MS准确鉴定。这表明培养时间在72 h内，在血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板培养的沙门菌可以被MALDI-TOF MS准确鉴定到沙门菌菌属，这足以满足临床对沙门菌检测的需求。

MALDI-TOF MS在鉴定沙门菌菌属时，与Vitek 2的检测结果完全一致，所有菌株均能准确鉴定到沙门菌菌属。但MALDI-TOF MS的耗材成本约为Vitek 2的1/3，检测时间约为Vitek 2的1/7。MALDI-TOF MS可以准确鉴定各种血清型的沙门菌。对于培养时间在3 d以内培养于血平板、HE平板、SS平板和麦康凯平板的沙门菌，MALDI-TOF MS均可以准确鉴定，比通过鉴别沙门菌的相关生化反应的传统鉴定方法所需的时间减少24 h以上。因为在SS平板和HE平板等选择性平板上，由于大多数沙门菌会产生H2S，H2S与培养基中的Fe离子在菌落中心形成黑色物质FeS, 从而影响生化反应的鉴定结果，因此需要将可疑菌株转接到血平板培养后再进行鉴定。在沙门菌属的水平上的鉴定，与Vitek 2相比，MALDI-TOF MS可以更快获得鉴定结果，消耗的成本费用更低，并且对于常用的选择性培养基，如HE平板、SS平板和麦康凯平板，其检测结果不会受到影响。

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Rapid identification onSalmonellaisolated from clinical specimens by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry

LIANG Da-wei, LIANG Quan-hui, FANG Yan-ping, JIANG Chang-hong,LONG Jun, ZENG Nian-yi,LIN Li-juan, JIANG Ling-xiao

(ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510000,China)

In this study, we aimed to evaluate the clinical application values of matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) forSalmonellaidentification and investigate its influencing factors. AllSalmonellaisolates were serotyped by traditional serological method.Salmonellaisolates were cultured for 24, 72, 120 and 168 h in Columbia blood agar, Hektoen Enteric (HE) agar, Salmonella Shigella (SS) agar and MacConkey (MAC) agar respectively. And then the strains were identified by MALDI-TOF MS. Thirty-eight serotypes were identified among 179Salmonellastrains and the top three serotypes wereSalmonellaenteritidis (21.2%),Salmonellastanley (17.3%) andSalmonellaⅠ4,5,12:i:-(16.2%). All isolates cultured in blood agar, HE agar, SS agar and MAC agar for 24 h and 72 h could be correctly identified by MALDI-TOF MS. The consuming cost of MALDI-TOF MS was about one third of microbial automatic biochemical identification system (Vitek 2) and its detection time was one seventh of Vitek 2.Salmonellacultured in Columbia blood agar, Hektoen Enteric agar,SalmonellaShigellaagar and MacConkey agar within three days could be correctly identified by MALDI-TOF MS. Compared with Vitek 2, MALDI-TOF MS provided a faster and lower-cost method that could also directly identifySalmonellaisolates cultured in selective medium.

Salmonella; matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry; identification

Jiang Ling-xiao, Email: jiang-lingxiao@163.com

江凌晓，Email：jiang-lingxiao@163.com

南方医科大学珠江医院检验医学部，广州510000

R446.5

A

1002-2694(2016)07-0600-04

2015-12-07；

2016-04-25

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.002

国家科技重大专项课题资助项目(No.2012ZX10004-213)