于庆生　经文善　宋加奎　张　琦　刘举达

(1 安徽中医药大学第一附属医院普外科，合肥，230031； 2 安徽省中医药科学院中医外科研究所，合肥，230061)



丹参及其联合5-FU对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响

于庆生1,2经文善1宋加奎1张琦1,2刘举达1,2

(1 安徽中医药大学第一附属医院普外科，合肥，230031； 2 安徽省中医药科学院中医外科研究所，合肥，230061)

目的：探讨中药丹参对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。方法：采用Annexin V-FITC/PI双染法，使用流式细胞仪检测不同浓度丹参、5-FU及二者联合对人胃癌SGC-7901细胞的凋亡率影响。采用荧光显微镜观察不同浓度丹参、5-FU及二者联合对人胃癌SGC-7901细胞凋亡数量的影响。结果：1)不同浓度丹参溶液作用于人胃腺癌SGC-7901细胞后，细胞的凋亡率大于阴性对照组，且随药物浓度的增加而增加；2)丹参、5-FU联合用药作用于人胃癌SGC-7901细胞后，细胞的凋亡率大于单纯丹参组和5-FU组，且随丹参药物浓度的增加而增加；3)通过荧光显微镜观察可见联合用药组细胞数量少于阴性对照组，凋亡细胞数随药物浓度的增加而增多。结论：丹参能引起人胃癌SGC-7901细胞形态变化，能促进5-FU诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡，且有剂量依赖性。

丹参；人胃腺癌SGC-7901细胞；凋亡

胃癌是临床常见的恶性肿瘤，占消化道肿瘤发病的第1位，确诊时90%已属进展期，尽管给予了包括广泛淋巴结清扫的肿瘤根治性切除，但仍有半数在5年内复发和转移，并最终导致死亡。直至目前，化疗被认为是防治胃癌术后复发和转移的最主要方法，但其总体疗效令人悲观，主要原因是肿瘤细胞存在着广泛的耐药性，且各种化疗药物都存在较大的不良反应。5-FU是临床胃癌化疗最常用的药物，众多研究表明[1-4]，中药丹参不仅能提高5-FU的抗癌疗效，而且可以减少其不良反应，但其确切机制尚未阐明。本文通过观察丹参对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响，揭示其抗肿瘤机制，为临床应用提供理论基础。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1肿瘤细胞人胃腺癌SGC-7901细胞由安徽医科大学第一附属医院中心实验室提供，来源于上海肿瘤研究所生物细胞库。

1.1.2药物与试剂注射用丹参(冻干)，哈药集团中药二厂生产，400 mg/支，生产批号：1310317；氟尿嘧啶注射液，天津金耀氨基酸有限公司生产，250 mg/支，生产批号：1310261；DMEM(高糖)培养基，自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，批号：NXK0732；胎牛血清，购自浙江天杭生物科技有限公司，批号：NVW0526；四甲基偶氮唑蓝(MTT)，北京绿生源科技有限公司；胰蛋白酶细胞消化液，自碧云天生物技术研究所，批号：CD201；二甲基亚矾(DMSO)，Sigma公司，批号：D8418；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒：上海贝博生物试剂公司，批号：401002。

1.1.3仪器洁净工作台：苏净集团安泰公司；FACS Calibur流式细胞仪：美国Becton Dickinson公司；荧光显微镜：德国徕卡DMI-6000B；5%二氧化碳恒温培养箱：日本Sanyo公司；CK2型倒置显微镜：日本Olympus公司；电子精密天平：上海精密科学仪器有限公司；培养/干燥箱：上海一恒科技有限公司；LD4-8型低速离心机：北京医用离心机厂；灭菌锅：日本Tomy KOQYO公司；培养瓶、96孔培养板：美国Corning公司；HF Super NW系列超纯水仪：上海康雷分析仪器有限公司；WD-9405B摇床：北京市六一仪器厂；垂直板电泳槽：BIO-RAD(PowerPac BasiC)公司；电热恒温箱：上海三发；漩涡混合器：其林贝尔仪器制造公司；离心机：安徽嘉文；双向磁力搅拌器：江苏省金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.2方法

1.2.1分组方法本实验分组有联合用药组、对照组和丹参组，其中联合用药组分3亚组，分别为：高剂量联合用药组(高联组)、中剂量联合用药组(中联组)、低剂量联合用药组(低联组)；对照组分2亚组，分别为：阳性对照组(阳性组)、阴性对照组(正常组)；丹参组分3亚组，分别为高剂量丹参组(高丹组)、中剂量丹参组(中丹组)、低剂量丹参组(低丹组)。

1.2.2给药方法给药剂量根据对丹参安全剂量及5-FU半数抑制浓度的筛选而定，高联组予丹参最大安全剂量及5-FU IC50值剂量，中联组给予丹参最大安全剂量的1/2及5-FU IC50值剂量，低联组予以丹参最大安全剂量1/4及5-FU IC50值剂量。阳性对照组(阳性组)和阴性对照组(正常组)分别予以5-FU IC50值剂量和完全培养基。高丹组予丹参最大安全剂量，中丹组予丹参最大安全剂量的1/2，低丹组予丹参最大安全剂量的1/4。

1.2.3药物配置方法取丹参冻干粉一支，用含10%胎牛血清的DMEM培养液稀释成10 mL丹参母液(浓度为40 000 mg/L)，吹打混匀后置于15 mL离心管中。同样，氟尿嘧啶注射液1支(2 500 mg∶10 mL)，用10 mL注射器轻轻吸取液体药物置于15 mL离心管中，分别存入-20 ℃冰箱避光保存，使用时将其按要求稀释到相应的工作浓度进行实验。

1.2.4细胞培养方法将人胃癌SGC-7901细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，置37 ℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，隔天全量换液。待贴壁细胞长满培养瓶底80%呈基本融合的状态时，予以胰酶消化后传代，约2～3 d传代1次，取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.5测定丹参对人胃癌SGC-7901细胞生长抑制作用的安全浓度方法将浓度为2×104/mL的细胞悬液接种到96孔板中，100 μL/孔；置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，然后分别加入配制的1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL和62.5 μg/mL 5个浓度的丹参完全培养液，同时设立阴性对照组(正常组)和空白对照组，阴性对照组加入不含药物的完全培养液，空白对照组在不含细胞的孔中加入完全培养液，终体积为200 μL/孔，每组设6个复孔，分别作用24 h、48 h和72 h。作用时间到后，将细胞与5 mg/mL MTT溶液共同置于37 ℃下孵育4 h，吸弃上清液，每孔加入150 μL DMSO，低速摇床上轻轻震荡15 min，在酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光度值(OD值)。将结果代入公式计算不同浓度的丹参对胃癌SGC-7901细胞抑制率。

抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组(正常组)OD值-空白孔OD值)]×100%。经计算得出丹参作用于人胃腺癌SGC-7901细胞24 h/48 h/72 h的安全浓度分别≤250 μg/mL、≤125 μg/mL、≤62.5 μg/mL。

1.2.6测定5-FU不同浓度对人胃癌SGC-7901细胞的半数抑制浓度(IC50值)方法将浓度为2×104/mL的细胞悬液接种到96孔板中，每孔100 μL；置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，接种于96孔板中的细胞分别加入配制的125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.625 μg/mL和7.812 5 μg/mL 5个浓度的5-FU完全培养液，并设立阴性对照组(正常组)和空白对照组，方法同上，最后在酶标仪570 nm波长处测定各孔吸光度值(OD值)，求出5-氟尿嘧啶对成纤维细胞半数抑制浓度(IC50值)。

抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白对照组OD值)/(阴性对照组(正常组)OD值-空白孔OD值)]×100%。经计算得出5-FU作用于人胃癌SGC-7901细胞24/48/72 h的IC50浓度值分别为279.043 μg/mL、62.533 μg/mL、13.509 μg/mL。

1.2.7观察指标及其检测方法

1.2.7.1人胃癌SGC-7901细胞的凋亡率流式细胞仪检测不同浓度丹参、5-FU及二者联合对人胃癌SGC-7901细胞的凋亡率(Annexin V-FITC/PI双染法)。

取人胃癌SGC-7901细胞，经0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，用10%胎牛血清的DMEM全培养液将细胞浓度调成4×104cells/mL。细胞以每瓶2 mL的细胞悬液接种到培养瓶中，再加入3 mL培养液，置于37 ℃、5%CO2培养箱。培养24 h后弃上清，PBS清洗两次，分别加入之前配制的125 μg/mL丹参+62.5 μg/mL 5-FU溶液、62.5 μg/mL丹参+62.5 μg/mL 5-FU溶液、31.25 μg/mL丹参+62.5 μg/mL 5-FU溶液和62.5 μg/mL 5-FU溶液4个浓度的溶液，即分别对应为高联组、中联组、低联组和阳性组；正常组为加入不含药物的新鲜完全培养液；同时设立丹参组：125 μg/mL丹参溶液、62.5 μg/mL丹参溶液和31.5 μg/mL丹参溶液，即分别对应为高丹组、中丹组和低丹组。每瓶细胞所加溶液量各5 mL，每个浓度组2瓶细胞，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养48 h。同时设立一个空白组，2个单染组(3组均为加入5 mL不含药物的新鲜完全培养液)。培养结束后PBS清洗2次，用不含EDTA的胰酶消化后离心，收集细胞PBS清洗后，加入400 μL 1×Annexin V结合液，制成浓度大约为1×106cells/mL细胞悬浮液。在细胞悬浮液中先后加入5 μL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液染色。空白组不加染色剂，2个单染组分别只加5 μL Annexin V-FITC染色液和10 μL PI染色液。采用流式细胞仪检测。

1.2.7.2凋亡细胞荧光显微镜下观察荧光显微镜下观察不同浓度丹参、5-FU及二者联合对人胃癌SGC-7901细胞凋亡情况。

表1　不同浓度丹参、5-FU以及两者合用人胃癌SGC-7901细胞凋亡率

注：**：与阳性对照组相比P<0.01，*：与阳性对照组相比P<0.05。

2　结果

2.1人胃癌SGC-7901细胞的凋亡率结果如表1，药物作用于人胃癌SGC-7901细胞48 h后，安全剂量区间内丹参(31.25 μg/mL、62.5 μg/mL、125 μg/mL)各组对人胃癌SGC-7901细胞的凋亡率均大于正常组(P<0.05)。并且药物丹参与5-FU之间存在交互作用(P<0.01)。其中，高剂量联合用药组与阳性对照组相比较后有统计学意义(P<0.01)，中剂量联合用药组与阳性对照组相比较后有统计学意义(P<0.05)，低剂量联合用药组与阳性对照组相比较后无统计学意义。

2.2凋亡人胃癌SGC-7901细胞荧光显微镜下观察结果如图1所示，染色后荧光显微镜下观察可见联合用药组、阳性对照组与正常组(阴性对照组)相比较，正常贴壁细胞密度变小，出现大量被染成绿色和红色的凋亡和坏死细胞。高剂量联合用药组、中剂量联合用药组与阳性对照组处理组变化亦有统计学意义，低剂量联合用药组与阳性对照组处理组变化不太明显。安全剂量内丹参(31.25 μg/mL、62.5 μg/mL、125 μg/mL)各组与正常组相比较组间总体统计学意义不明显，但丹参组有少量凋亡细胞出现，特别是中剂量丹参组和高剂量丹参组。

图1　丹参、5-FU以及两者合用对SGC-7901细胞作用48 h染色后荧光显微镜镜下观察

注：A：高剂量联合用药组(125 μg/mL丹参+62.5 μg/mL 5-FU)；B：中剂量联合用药组(62.5 μg/mL丹参+62.5 μg/mL 5-FU)；C：低剂量联合用药组(31.25 μg/mL丹参+62.5 μg/mL 5-FU)；D：阳性对照组(62.5 μg/mL 5-FU)；E：阴性对照组：无药物的完全培养液；F：低剂量丹参组(31.25 μg/mL丹参)；G：中剂量丹参组(62.5 μg/mL丹参)；H：高剂量丹参组(125 μg/mL丹参)。

3　讨论

细胞凋亡是生物细胞为维持内环境稳定而受基因调控的主动自杀过程，可以清除多余无用、衰老、突变的细胞，是机体生长发育、维持健康的基础[5]。而肿瘤细胞的特征之一就是缺乏这种程序性的死亡过程，细胞凋亡受阻在肿瘤的发生中占有重要地位，如何诱导肿瘤细胞凋亡已作为肿瘤治疗研究的新热点[6]。

细胞凋亡检测方法多样。Annexin V可与早期凋亡细胞转移至胞膜外的磷脂酞丝氨酸及已凋亡细胞外侧的磷脂酞丝氨酸结合染色[7]；碘化丙啶(PI)可以透过凋亡中晚期及凋亡细胞的细胞膜而使细胞核染色，但不能通过完整的细胞膜[8]。单独用Annexin V-FITC法不能区分细胞凋亡各期，因此采用Annexin V-FITC/PI 双染可以将凋亡各期细胞及已凋亡细胞区分开来[7-8]。流式细胞仪是对高速直线流动单细胞悬液进行快速定量测定和分析的仪器，其优点是简单、快速、准确、灵敏，当细胞发生凋亡缓慢和不一致时，检测更为准确[9-10]。采用Annexin V-FITC/PI双染法，使用流式细胞仪检测不同浓度丹参、5-FU及2者联合对人胃癌SGC-7901细胞的凋亡率影响，结果表明，不同浓度丹参溶液作用于人胃腺癌SGC-7901细胞后，细胞的凋亡率大于阴性对照组，且随药物浓度的增加而增加；丹参、5-FU联合用药作用于人胃癌SGC-7901细胞后，细胞的凋亡率大于单纯丹参组和5-FU组，且随丹参药物浓度的增加而增加。荧光显微镜观察是以紫外线为光源，照射染色后的物体，较为直观的观察细胞形态，是检测细胞凋亡的重要手段之一[11]。本研究采用荧光显微镜观察不同浓度丹参、5-FU及2者联合对人胃癌SGC-7901细胞凋亡数量的影响。结果表明，联合用药组细胞数量少于阴性对照组，凋亡细胞数随药物浓度的增加而增多。

中医学认为，机体实体肿瘤多是痰、瘀互结的结果，活血化瘀、化痰散结是中医治疗恶性肿瘤的最基本法则。研究表明[12-13]，中医中药可以诱导肿瘤细胞凋亡，提高肿瘤的治疗效果。丹参味苦，性微寒，入心、肝经，是传统具有代表性的活血化瘀药，很容易推测该药可能具有抗肿瘤作用。诸多的临床和动物实验研究证实[14-18]，丹参具有广谱的抗肿瘤作用，当丹参联合5-FU使用时可以显著提高肿瘤的治疗效果，并且可能与促进肿瘤细胞的凋亡关系密切[19-21]。但对人胃癌SGC-7901细胞的影响及其机制尚不清楚。

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(2015-08-23收稿责任编辑：徐颖)

The Effect of Salvia Miltiorrhiza and its Combination with 5-FU on Apoptosis of Human Gastric Cancer SGC-7901 Cells

Yu Qingsheng1,2, Jing Wenshan1, Song Jiakui1, Zhang Qi1,2, Liu Juda1,2

(1DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofAnhuiTraditionalChineseMedicineUniversity,Hefei230031,China; 2InstituteofChineseMedicineSurgery,AnhuiChineseMedicineAcademyofSciences,Hefei230061,China)

Objective: To observe the effects of Salvia miltiorrhiza on apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells. Methods: To test the effects of different concentrations of Salvia miltiorrhiza, different concentrations of 5-FU, and the mixtures on apoptosis rate of human gastric cancer SGC-7901 cells by flowing cytometry after AnnexinV-FITC/PI staining. To observe the effects of different concentrations of Salvia miltiorrhiza, different concentrations of 5-FU, and the mixtures on number of apoptosis of human gastric cancer SGC-7901 cells by fluorescence microscope. Results: 1) The apoptosis rate of human gastric cancer SGC-7901 cells that disposed with different concentrations of Salvia miltiorrhiza is higher than the control group, and the apoptosis rate has raised with the increase of concentration of Salvia miltiorrhiza.2) The apoptosis rate of human gastric cancer SGC-7901 cells that disposed with combination therapy group is higher than that of the group disposed by only Salvia miltiorrhiza or 5-FU, and the apoptosis rate increased with the increase of concentration of Salvia miltiorrhiza. 3)Using the Fluorescence microscopy, we can find that the number of the intact cells in Salvia miltiorrhiza combined with 5-Fu groups were all lower than the control group, and the number of apoptotic cells has increased with the drug concentration increasing. Conclusion: Salvia miltiorrhiza can cause human gastric cancer SGC-7901 cell morphological changes and accelerate 5-FU induce the apoptosis of cell, which was correlated with dose.

Salvia; Human gastric cancer SGC-7901 cells; Apoptosis

十二五国家临床重点专科建设项目(编号：财社〔2013〕239号)

于庆生(1963.12—)，男，教授，主任医师，博士生导师，安徽省中医药科学院中医外科研究所所长，普外科主任，外科教研室主任，研究方向：胃肠外科基础与临床，E-mail：qsy6312@163.com

R285

A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.07.043