颜国富　杜亮亮



滋肾活血丸对DN大鼠肾脏保护作用的研究*

颜国富杜亮亮

湖南省岳阳市中医院内分泌科(岳阳 414000)

摘要：目的观察滋肾活血丸对DN大鼠肾脏的保护作用及足细胞损伤的影响。方法40只大鼠随机分为对照组、模型组、滋肾活血丸组、苯那普利组，每组各10只，测定生化指标；光镜检查肾组织病理变化，电镜及免疫荧光法检测肾组织及尿液中足细胞变化等并进行观察。结果实验12周后，模型组大鼠血糖、24 小时尿蛋白定量、BUN、Scr较正常对照组明显增高(P<0.05)；滋肾活血丸组和苯那普利组与模型组比较大鼠24 h尿蛋白定量、BUN、Scr均有不同程度降低(P<0.05)，但滋肾活血丸组远期疗效更为显著。结论滋肾活血丸可减轻糖尿病肾病大鼠足细胞损伤，具有一定的肾保护作用。

关键词：滋肾活血丸；糖尿病肾病；肾功能；足细胞

糖尿病肾病( diabetic nephropathy，DN)，是引起成人后天性终末期肾病的主要原因。研究表明，DN所引起的一系列症状均与蛋白尿相关，导致蛋白尿的关键因素是足细胞损伤[1～2]。笔者的前期研究表明滋肾活血丸对糖尿病肾病有明显保护作用，本实验进一步研究了滋肾活血丸在糖尿病大鼠模型中的作用机制。

1　材料与方法

1.1实验动物选用清洁级健康雄性Wistar大鼠40只，体质量(160±20) g，10周龄，由中南大学医学实验动物中心提供，合格证号：2012A066。

1.2试验药物及仪器设备链脲佐菌素(STZ)为Sigma公司产品；苯那普利片由北京诺华制药有限公司提供(国药准字H20000292)；滋肾活血丸由我院中药房提供(批号:008213)；兔抗大鼠Podocalyxin多抗及FITC-山羊抗兔IgG,购自SANTA CRUZ公司。血糖仪为美国强生公司产品；全自动多功能生化分析仪为日本HITACH公司产品；光学显微镜为日本OLYMPUS公司产品。

1.3模型制作三联法制备2型糖尿病肾病模型：(1)切除大鼠右肾, 继而高糖高脂饮食诱导。(2)小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射，破坏大鼠的部分胰岛B细胞，使大鼠出现糖尿病肾病的早期病变如：肾小球滤过率增加、微量白蛋白尿等。高糖高脂饮食：常规饲料加 20%蔗糖，10%猪油、2.5%胆固醇。手术方法：大鼠腹腔注射氯氨酮(70mg/kg)麻醉后将右肾切除。STZ为sigma公司产品，按30mg/kg腹腔注射，造模时间共 6周。

1.4动物分组与给药方法40只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病模型组(模型组)、滋肾活血丸组、苯那普利组，每组各10只。滋肾活血丸组每日每只灌胃滋肾活血丸(3 g/kg/d)，苯那普利组每日每只灌胃苯那普利(2.5 g/kg/d)，对照组大鼠腹腔注射相应的柠檬酸盐溶液，每日给予等量的饮用水，模型组每日给予等量的饮用水。实验周期为12周。

1.5标本提取及指标检测

1.5.1生化指标分别在实验的2、4、6、8、12周末测定大鼠血糖及24小时尿蛋白定量。12周后测定肾脏指数(RI) =左肾质量(LRW)/大鼠体质量(BW)×100。肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、Scr、BUN；均采用全自动多功能生化分析仪进行测定。

1.5.2光镜观察12周末采血后取部分肾组织放入10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，常规切片并行HE染色，采用光镜观察结果。

1.5.3电镜观察观察亚细胞结构的病理改变及肾微血管超微结构的改变。每只大鼠肾组织在42000X放大倍数下观察，取30个视野，每只大鼠最少观察100个足细胞，使用计算机图像分析软件采集足细胞数量，裂孔隔膜数量及范围，观察肾小球基底膜的厚度。

1.5.4免疫荧光染色检测(1)各组均收集大鼠24小时尿液40ml，PBS重悬尿沉渣两次后细胞涂片；(2)4%多聚甲醛固定20 分钟后PBS洗1次，再滴加0.2%Triton-X100，5分钟后PBS洗3次；然后3%BSA封闭40分钟后滴加抗兔抗大鼠podocalyxin多抗(1:200)，4℃孵育；(3)第二天采用PBS漂洗后加山羊抗兔IgG-FITC(1:1000)，避光孵育1小时后再次漂洗，Hoechst(1:2 000)细胞核染10分钟后漂洗，擦干封片。(4)采用全自动多功能荧光显微镜观察，发绿色荧光者为阳性。

2　结果

2.1对大鼠血糖的影响见表1。

组别2周4周6周8周12周对照组4.79±0.924.50±1.004.75±0.985.29±0.264.74±1.04模型组17.80±1.5417.51±2.0318.55±1.9719.63±2.1120.76±1.771)苯那普利组17.11±1.7717.00±1.0618.53±2.2320.62±2.4120.33±1.651)2)滋肾活血丸组18.02±2.2517.28±1.5017.42±1.0818.20±1.0118.23±2.061)2)3)

注：与对照组比较1)P<0.05，与模型组比较2)P>0.05，与苯那普利组比较3)P>0.05。

2.2对大鼠尿蛋白的影响见表2。

表2　各组大鼠尿蛋白变化　±s)

注：与对照组比较1)P<0.05，与模型组比较2)P<0.05，与苯那普利组比较3)P<0.05。

2.3对大鼠肾脏的影响见表3。

表3　各组对大鼠肾脏的影响　±s)

注：与对照组比较1)P<0.05，与模型组比较2)P<0.05，与苯那普利组比较3)P<0.05，与苯那普利组比较4)P>0.05。

2.4肾组织病理学观察

2.4.1光镜检查对照组：肾小球、肾小管及肾间质无明显病理改变。模型组：肾小球体积增大，毛细血管腔受压变窄，基底膜增厚，系膜物质增多，肾小管上皮细胞空泡样变。苯那普利组：毛细血管丛内血管腔尚清晰，系膜区增宽，部分基底膜增厚。滋肾活血丸组：毛细血管丛内血管腔清晰，系膜区稍增宽，肾小囊与正常组比较无差异，部分基底膜稍增厚。

2.4.2电镜检查对照组：足细胞密度正常，足突排列整齐，未见融，系膜区ECM量正常。模型组：足细胞数量明显减少，系膜增宽，基底膜可见弥漫性增厚，变性，足突融合。滋肾活血丸组：足突融合减轻，部分区域可见完整足突排列。苯那普利组：可见与滋肾活血丸组类似改变。

3　讨论

DN的主要病理实质为与血糖代谢异常有关的肾小球硬化症，病理特征为肾小球细胞外基质(extracellular matrix，ECM) 过度积聚，基底膜增厚，系膜增宽，间质纤维化及肾小球硬化。糖尿病肾病相关研究发现，高血糖可直接引起及肾小球硬化，肾小球滤过率增加，最终导致蛋白尿。研究还表明DN患者足细胞数量减少与肾小球的硬化程度呈正相关[3]。足细胞数量减少最主要的原因为足细胞从肾小球基底膜的脱落及凋亡，而使足细胞从尿液丢失增多。足细胞可通过分泌ECM及相关降解酶类来调节肾小球基膜(GBM)代谢[4]，能维持GBM代谢平衡，增加足细胞与GBM之间的粘附，有效保障肾脏正常的滤过功能。长期持续的高血糖可以下调Podocalyxin的表达，引发足细胞的分泌功能，最终导致蛋白尿的发生[5]。关于修复DN所致的滤过膜的损伤，广大医务工作者一直认为具有不可逆性，最终难免进入透析期，目前已有研究表明多种中药对DN有重要的治疗作用[6～8]，可以作为研究治疗DN的新途径。滋肾活血丸为我院内分泌专科经验方滋肾活血汤经反复临床试验，改良剂型，自行研发的院内制剂之一，临床应用多年，具有明显降低患者24小时尿蛋白含量及显著改善患者肾功能的作用。组方中以经方六味地黄丸滋补肾阴，辅以黄芪补气固表、利尿托毒，丹参、水蛭、益母草、鬼箭羽活血祛瘀、 利水消肿，佐少量苍术、鸡内金、大黄即可健脾燥湿、又可逐瘀通经。课题组前期临床研究表明滋肾活血丸对于患者血脂、血糖代谢的影响与两组患者基础治疗相关，长期服用对于患者糖化血红蛋白含量的下降趋势呈正相关[7～8]，可有效降低高血糖对足细胞的毒性作用，有效保护患者肾功能。

本研究结果显示，与正常大鼠比较，模型组大鼠造模成功后在高血糖不断作用下逐渐出现尿蛋白增多、肾脏病理损伤等DN特征性表现，后期出现肾功能受损。统计分析表明，滋肾活血丸组与苯那普利组与模型组比较，二者均能不同程度改善DN大鼠肾功能，降低血清肌酐及尿素氮水平，用药后肾组织病理损伤也明显减轻。通过对大鼠蛋白尿影响的研究表明，两治疗组均能不同程度的减少DN大鼠蛋白尿，统计学分析P<0.05，且滋肾活血丸组在远期(8周至12周)疗效优于苯那普利组(经比较P<0.05)，说明滋肾活血丸与苯那普利都具有肾保护作用，在消除蛋白尿方面滋肾活血丸的远期疗效优于苯那普利组。两组大鼠血糖与模型组比较有所下降，但差异无统计学意义。本研究提示，滋肾活血丸能够通过对足细胞的修复，改善DN患者蛋白尿，对早期DN的肾脏起到保护性作用，有望为临床药物开发和中西医、药结合治疗肾脏疾病探索出一条新的途径。

参考文献

[1]Miyauch M, Toyodal,M,Kobayashi,et al.Hyhpertrophy and Loss of Podoeytes in Diabetic Nephropathy [J].Inter Med,2009:48:1615

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[3]Li JJ,Kwak S,Jung,DS.podocyte biology in diabetic nephropathy[J].Int Suppl,2007,106(1):36-42.

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[7]颜国富,李淑君,胡仙,等. 滋肾活血汤对2型糖尿病大鼠血管病变及肾脏保护的研究[J].中医药导报,2013,8(19):77-78.

[8]颜国富, 杜亮亮,李淑君,等. 自拟滋肾活血丸联合常规疗法治疗早期糖尿病肾病30例临床观察 [J].中医药导报,2013,10(19):39-40.

*基金项目：湖南省中医药管理局资助课题(No.2013120)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.01.025

文章编号：1003-8914(2016)-01-0054-03

收稿日期：(本文校对：李淑君2015-04-10)

The Study on the protective effect of Zishen Huoxue Pills on Kidney of DN rats

YAN GuofuDU Liangliang

(Department of Endocrinology, Yueyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hunan, Yueyang 414000, China)

Abstract：ObjectiveTo observe the protective effect of Zishen Huoxue pills on the kidney of DN rats as well as the impact on podocyte injury. Method40 rats were randomly divided into control group, the model group, the Zishen Huoxue pills group and the benazepril group, and each group had 10 rats. Their biochemical indicators were determined. The renal biopsy pathology was checked through light microscopy. The podocyte changes in renal tissue and urine were observed by electron microscopy and immuno fluorescence method. ResultsAfter experiments for 12 weeks, the blood glucose, the urine protein in 24 hours, BUN and Scr in rats of the model group were significantly higher than those of the control group (P<0.05). The urine protein in 24 hours, BUN and Scr in rats of the Zishen Huoxue pills group and the benazepril group declined in different degrees compared with the model group (P<0.05). The Zishen Huoxue pills group had remarkable long-term curative effects. Conclusion: The Zishen Huoxue pills can relieve the podocyte injury of the rats with diabetic nephropathy, and had certain renal protective effect.

Key words：Zishen Huoxue pills; Diabetic nephropathy; Renal function; Podocyte