王再红，高兆芳，李海刚，李鸿波，张　静，杨燕君

(1.河北省秦皇岛市海港医院呼吸科，河北 秦皇岛 066000；2.北京市第二医院综合内科，北京 100031)



长期吸烟对肺癌组织B7-H4、P53表达的影响及临床意义

王再红1，高兆芳1，李海刚1，李鸿波1，张静1，杨燕君2

(1.河北省秦皇岛市海港医院呼吸科，河北 秦皇岛 066000；2.北京市第二医院综合内科，北京 100031)

[摘要]目的 比较长期吸烟和非长期吸烟肺癌患者癌组织、癌旁组织及周边组织含V-Set域的T细胞激活抑制因子(V-Set domain-containing t-cell activation inhibitor 1，B7-H4)、P53表达的差异,探讨长期吸烟对B7-H4、P53在肺癌及周边组织表达的影响及其临床意义。方法选择肺癌患者115例,其中吸烟组65例,非吸烟组50例。采用免疫组织化学方法检测2组中肺癌组织、癌旁组织及周边组织B7-H4和P53蛋白的表达。结果2组癌组织中B7-H4、P53阳性表达均高于癌旁组织及周边组织(P<0.05)；吸烟组癌旁组织和周边组织B7-H4、P53阳性表达均高于非吸烟组(P<0.05)。B7-H4、P53在吸烟组和非吸烟组肺癌组织中的表达均呈正相关。结论吸烟可使肺组织B7-H4、P53蛋白高表达，二者具有协同作用,促进肿瘤的发生发展。

[关键词]肺肿瘤；吸烟；基因表达

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.022

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。全球每年新发肺癌120万例，平均每30 s就有1人死于肺癌。其中，中国每年有60多万人死于肺癌[1]。大量的流行病学调查显示肺癌与吸烟的关系最为密切。吸烟者除了吸入烟草中含有的多种化学致癌物，还可导致基因的改变[2]。共刺激分子B7家族中的重要成员含V-Set域的T细胞激活抑制因子(V-Set domain-containing t-cell activation inhibitor 1，B7-H4)[3]，可介导肿瘤的发生及发展[4-5]，其在正常上皮中不表达或低表达，在多种肿瘤高表达。野生型P53是有代表性的抑癌基因，但突变的P53失去了抑癌作用，具有了致癌作用。本研究检测B7-H4、P53在长期吸烟与非吸烟肺癌患者术后癌组织、癌旁组织及周边组织中表达的差异，旨在探讨吸烟对肺癌的作用。现报告如下。

1　资料与方法

1.1一般资料收集2011年1月—2013年3月在河北省秦皇岛市海港医院行根治手术并经病理确诊为肺癌的患者115例。其中高分化58例，中分化41例，低分化16例。排除标准：术前接受放疗、化疗或其他针对肿瘤治疗的患者及被动吸烟的患者。所有纳入研究的肺癌患者吸烟史明确，并且临床资料完整。按1984年世界卫生组织关于吸烟调查方法的标准建议：如果每天吸烟1支以上，时间长于1年者为吸烟，吸烟量1～9支/d为轻度，10～19支/d为中度，20支以上为重度。由于部分病例中仅有吸烟年限的记录，而吸烟年限也能够在一定程度上反映出其吸烟量的多少，故将其吸烟年限<10年者定位轻度，11～19年为中度，20年以上为重度。本研究中所指的长期吸烟为吸烟支数20支/d以上、吸烟年限20年以上。据此分为吸烟组65例，男性 43例，女性22例，年龄34～71 岁，平均(56.17±4.28)岁。非吸烟组50例，男性36例，女性14例，年龄36～74岁，平均(58.12±4.56)岁。2组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2B7-H4、P53蛋白的检测方法本研究B7-H4和P53蛋白浓缩液购自武汉博士德生物工程有限公司，按不同比例稀释后进行预实验，选取最理想表达的浓度进行正式实验。2种蛋白的实验检测均应用免疫组织化学二步法。严格按实验步骤操作，努力减少误差。

1.3免疫组织化学结果的判定B7-H4以细胞膜和(或)细胞质内出现黄色颗粒为阳性反应细胞，P53以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性反应细胞。计数5个400倍的高倍视野，取其平均值作为最终的阳性表达率，以阳性细胞≥5%定为阳性，<5%定为阴性。

1.4统计学方法应用SPSS 17.0软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1免疫组织化学检测B7-H4、P53表达B7-H4、P53在吸烟组和非吸烟组肺癌组织中均高表达，均明显高于癌旁组织和周边组织(P<0.05)；吸烟组癌旁组织和周边组织B7-H4和P53的表达均高于非吸烟组的癌旁组织和周边组织，差异有统计学意义(P<0.05)；但吸烟组与非吸烟组癌组织B7-H4、P53表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　2组肺癌组织、癌旁组织及周边组织中B7-H4、P53表达比较　(例数，%)

*P<0.05与同组癌组织比较#P<0.05与同组癌旁组织比较(χ2检验)

2.2相关性分析在2组肺癌组织中B7-H4的表达与P53的表达呈正相关(吸烟组rs=0.339、P=0.006，非吸烟组rs=0.477、P=0.000)。提示两者在肺癌的发生发展中可能具有协调作用。

3　讨　　论

肺癌的发生发展是多阶段、多基因、多因素共同作用的结果。吸烟是导致肺癌的首位危险因素，90%肺癌的发病与吸烟有关，并且肺癌中吸烟者的病死率亦高于不吸烟者。Meta分析表明吸烟初始年龄越早，吸烟时间越长，吸烟总量和每日吸烟量越大，吸烟深度越深，戒烟时间越短，发生肺癌的危险性就越大。吸烟导致肺癌发生的机制包括自由基氧化损伤、癌基因与抑癌基因的突变、肺部炎症损伤等。研究表明，烟草烟雾中含有多种致癌物可经体内代谢酶的作用激活，形成亲电子产物，损伤DNA并使基因突变，从而导致肺癌的发生[2]。B7-H4、P53在肿瘤发生发展过程中均起了重要的作用。本研究通过检测B7-H4、P53在长期吸烟和非长期吸烟肺癌患者癌组织、癌旁组织及周边组织表达的差异,探讨长期吸烟对B7-H4、P53在肺癌及周边组织表达的影响及其临床意义。

B7-H4分子含有282个氨基酸[6-7]，属于B7-CD28共同刺激分子超家族，主要表达于抗原提呈细胞等多种细胞的表面，与其他B7成员不同，B7-H4并没有明显的跨膜区，在肿瘤发生的免疫应答过程中起到重要作用。人B7-H4蛋白能通过降低细胞因子产生即减少机体IL-2和IL-4的分泌，抑制CD4+和CD8+的T细胞活化，阻滞T细胞周期进展，使T细胞停留在G0/G1期，从而抑制T细胞增殖进展[7-10]。正常生理状况下，协同共刺激分子B7-H4通过抑制T淋巴细胞增殖，发挥负性调节T细胞介导的免疫应答作用，以维持机体内环境稳定，但B7-H4异常高表达可使机体由对肿瘤的免疫监视发展为对肿瘤的免疫耐受，从而实现肿瘤免疫逃逸，最终导致肿瘤的发生[10]。本研究结果显示，吸烟组及非吸烟组肺癌组织中B7-H4均高表达，从而推断肺癌组织中B7-H4的高表达，使得肺癌组织具备了逃逸机体免疫监视的能力，促进了肺癌的恶化和转移；吸烟组癌旁组织和周边组织B7-H4阳性表达均高于非吸烟组(P<0.05)，推断吸烟暴露促进了B7-H4蛋白的高表达，从而揭示吸烟通过对B7-H4表达的影响而促进肺癌的发生。

P53基因是于1979年发现的一种可以编码蛋白的基因。开始认为它是一种癌基因，但随着进一步研究发现P53基因是一种重要的抑癌基因，近年来一直受到广泛的关注[11]。其编码的P53蛋白能够通过调节基因转录来应对DNA损伤、癌基因信号激活及基因毒性应激等不利因素。P53蛋白是一种核内磷酸化蛋白，它以四聚体形式与DNA结合，分布于细胞核中。近年来有研究提示P53基因是人类恶性肿瘤中突变频率最高的基因之一[12]。突变的P53基因在多种肿瘤中高表达，获得了致癌功能，是细胞凋亡的调控因子[13]，可促进细胞转化和增殖，促进肿瘤进展[14]。有研究表明，P53基因在肺癌组织中基因突变的检出率可以高达60%～80%。野生型P53蛋白在细胞中的含量很低，且半衰期极短，所以很难检测出来。本研究检测的亦为突变型P53蛋白，显示吸烟组及非吸烟组肺癌组织中P53蛋白高表达，且明显高于癌旁组织及周边组织。这与卞安春等[15]研究一致，他们发现突变型P53蛋白在肺腺癌组织中的表达率为63.7%，并且与肺癌大小及病理分期有关，通过多因素生存分析显示P53基因突变的肺腺癌患者预后较差。本研究结果还显示，吸烟组癌旁组织和周边组织P53阳性表达均高于非吸烟组(P<0.05)。说明P53基因与肺组织癌变过程密切相关，而有烟草暴露的情况下P53基因容易发生突变，提示吸烟与P53基因突变之间存在相关，并且存在P53基因突变时患者预后较差。

烟草烟雾中含有4 000多种化学物质，其中大多数为致癌物质，包括一氧化碳、尼古丁和烟焦油，分为气相和颗粒相两部分。大部分化学致癌物在酶的作用下产生自由基而引起DNA突变[1]。本研究中B7-H4、P53在吸烟组及非吸烟组肺癌组织中均呈现高表达，且明显高于癌旁组织和周边组织；B7-H4、P53在2组肺癌组织中的表达呈正相关。提示B7-H4和P53的高表达，能促进肿瘤的发生，两者具有协同作用，表明肺组织癌变过程与B7-H4、P53基因密切相关。B7-H4、P53在吸烟组癌旁组织和周边组织的表达阳性率均高于非吸烟组癌旁组织和周边组织， 从而推断B7-H4、P53基因的突变为吸烟暴露所致。

总之，深入研究B7-H4、P53与肿瘤的关系，将有助于进一步揭开肿瘤的发病机制和对肿瘤进行早期的临床诊断，并为肿瘤的免疫治疗提供新的干预策略和治疗靶点。

[参考文献]

[1]张蕾,张福营,赵婷,等.蛋白质组学在肺癌研究中的应用进展[J].中国医药生物技术，2013,8(1):58-61.

[2]许德兵,吴凌云.miRNA与肺癌关系的研究进展[J].东南国防医药，2014，16 (1)：73-75,80.

[3]张羽,陈曾燕.B7-H4在上皮性卵巢癌中的表达及意义[J].临床肿瘤学杂志,2013,18(12):1104-1107.

[4]陈俊俊，石红兵，郑晓，等.可溶性B7-H4分子在乳腺癌患者血清中的表达及其临床意义[J].临床肿瘤学杂志，2012，17(7)：597-600.

[5]郑文凤,李颖霞,陈奎生,等.USP22、MTA1及Ki67蛋白在食管鳞癌中的表达及相关性[J].世界华人消化杂志,2013,21(28):2915-2921.

[6]刘思海,冯雯,郝岷,等.肺癌CT征象与病理及血清可溶性B7-H4检测临床意义[J/CD].中华消化病与影像杂志：电子版,2013,3(5):5-8.

[7]张波,买买提·吐尔逊木明,庞作良.血清可溶性B7-H4在非小细胞肺癌患者中的表达及临床意义[J].山东医药,2012,52(20):84-86.

[8]刘维辉,李永生,朱绍兴,等.B7-H4在膀胱尿路上皮癌组织和血清中的表达及临床意义[J].现代泌尿生殖肿瘤杂志,2012,4(5):297-300.

[9]姜孝新,伍小平,蒋艳.肺癌患者血清可溶性B7-H4分子的检测及其临床意义[J].武汉大学学报：医学版,2012,33(1):81-83，133.

[10]王利飞，崔澂，刘翠莲，等.协同共刺激分子B7-H4参与肿瘤免疫逃逸的研究进展[J].中国免疫学杂志,2015,31(1)：139-141.

[11]Muller PA,Vousden KH.Mutant p53 in cancer:new functions and therapeutic opportunities[J]. Cancer Cell,2014,25(3):304-317.

[12]Kandoth C,McLellan MD,Vandin F,et al. Mutational landscape and significance across 12 major cancer types[J]. Nature,2013,502(7471):333-339.

[13]Choudhury S,Kolukula VK,Preet A,et al. Dissecting the pathways that destabilize mutant p53:the proteasome or autophagy?[J]. Cell Cycle,2013,12(7):1022-1029.

[14]Chen S,Wang DL,Liu Y,et al. RAD6 regulates the dosage of p53 by a combination of transcriptional and posttranscriptional mechanisms[J]. Mol Cell Biol,2012,32(2):576-587.

[15]卞安春，李忠佑，许有涛，等.突变型P53蛋白在肺腺癌中的表达及其临床意义[J].中国肺癌杂志，2015，18(1)：23-28.

(本文编辑：许卓文)

[收稿日期]2015-08-07；[修回日期]2015-11-13

[作者简介]王再红(1973-)，女， 河北昌黎人，河北省秦皇岛市海港医院副主任医师，医学学士，从事呼吸内科疾病诊治研究。

[中图分类号]R734.2

[文献标志码]B

[文章编号]1007-3205(2016)04-0582-03