蔡晶晶，王雅洁(综述)，严继贵(审校)

(安徽医学高等专科学校药学系生物制药教研室，安徽 合肥 230601)



纤维连接蛋白EDA片段功能及临床应用前景研究进展

蔡晶晶，王雅洁(综述)，严继贵*(审校)

(安徽医学高等专科学校药学系生物制药教研室，安徽 合肥 230601)

[关键词]纤连蛋白类;EDA片段；综述文献

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.033

蛋白结构域A(extra domain A， EDA)是纤维连接蛋白(fibronectin, FN)的可剪切结构域之一，在机体的胚胎发育、血管生长、细胞迁移及细胞分化中发挥重要作用，与肿瘤、纤维化、血栓等多种疾病相关。现就EDA的结构、生物学功能以及EDA临床应用研究进展综述如下。

1　EDA的结构与位置

FN是构成细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的一种大分子糖蛋白，FN有2种形态，可溶型FN由肝脏实质细胞分泌直接释放至周围环境中，不溶型FN沉积于组织ECM中。FN由2条结构相近相对分子质量约为250 000的亚基组成，亚基由3种不同类型的重复序列组成(12 typeⅠ、2 typeⅡ和15 typeⅢ)，FN的pre-mRNA可选择性剪切从而产生20余种变体，其中部分FN Ⅲ区域产生的剪切变体中含有EDA外显子与蛋白结构域B(extra domain B，EDB)外显子，EDA位于FNⅢ 11与12之间，EDB位于FNⅢ 7与8之间[1-2](图1)。成人正常组织中往往没有EDA，但是在组织修复、组织纤维化、血管生成和细胞迁移等特定条件下EDA表达量会上调。

图1　纤维连接蛋白结构

2　EDA的生物学功能

2.1参与胚胎血管生成与肿瘤血管发育在脊椎动物的胚胎发育阶段EDA含量非常丰富，它们在胚胎发生、血管生长、细胞迁移与细胞分化中发挥重要作用。纯合子突变小鼠实验证实，FN基因中EDA与EDB的缺失会造成胚胎心血管发育异常，造成血管出血、卵黄囊血管无法构建、心脏血管缺陷等一系列病症，从而致胚胎死亡，其发生机制可能与内皮细胞的极性缺失有关，导致形成异常的管状结构。但EDA或者EDB单个的缺失并不影响血管的发育，原因可能是EDA与EDB的功能在某些方面存在互补。尽管EDA在胚胎血管形成时表达，但成人组织正常情况下检测不到，而在肿瘤血管生成与基质重建时重新出现，EDA+FN及其mRNA在肝癌、结肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤等肿瘤的血管内皮细胞、血管平滑肌及血管周围基质中普遍呈高表达，提示EDA与肿瘤血管的生成也具有密切的关系[2]。

2.2在淋巴管发育与肿瘤淋巴转移中的作用EDA+FN在淋巴管形成与发育中有关键的作用，研究表明在胚胎发生期间，由α9整合素表达的上调和EDA+FN在ECM的沉积共同激发淋巴瓣小叶的形成，若EDA-α9整合素相互作用缺失则会导致瓣膜发育缺陷。EDA可以促进淋巴管生成中一些关键因素如转录因子Prox1、纤维状激动蛋白(F-actin)的分泌与表达，从而促进人淋巴管内皮细胞的出芽、迁移[3]。鼠移植结肠瘤模型中，EDA可以通过促进血管内皮生长因子C(vascular endothelial cell growth factor C,VEGF-C)的分泌来促进肿瘤生长与肿瘤淋巴管的生成，并促进肿瘤细胞的淋巴道转移[4]，EDA有望成为一种有效抑制肿瘤淋巴转移的治疗目标。

2.3在组织纤维化中的作用EDA+FN参与肺纤维化、肝纤维化、肾间质纤维化等病理性进程，究其原因：EDA+FN可作为 转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)的重要底物参与诱导成纤维细胞增殖分化、上皮间质转化、成纤维细胞的胞外基质产生、巨噬细胞脂蛋白代谢、组织纤维化等[5-6]。在组织创伤部位TGF-β被激活，活化的TGF-β促进FN的选择性剪接提高EDA的表达，TGF-β与EDA+FN相互作用促使纤维原细胞(成纤维细胞)向表达α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin,SMA)的肌成纤维细胞转化并产生纤维化。在敲除了EDA基因的小鼠模型损伤部位则不能实现这种转化，继而也不能形成纤维化组织[7]。

2.4在血栓形成中的作用FN参与血小板的血栓形成，它与血小板表面受体结合，并通过凝血因子ⅩⅢ共价连接于血纤蛋白。血小板α颗粒中含有EDA+FN，并在动脉粥样硬化、肺和血管急性损伤、糖尿病、血小板减少性紫癜与缺血性卒中等疾病发生时表达量明显增加。EDA+FN影响血浆脂蛋白的代谢与泡沫细胞的形成，EDA缺陷型小鼠发生动脉粥样硬化的概率则大幅度降低。而纯合子EDA+/+小鼠血浆FN表达量只有野生鼠的20%～30%，其血栓形成的速率却较野生鼠大幅度增加[8]。表明EDA+FN的病理性上调会显著增加机体血栓形成的风险。

3　EDA的相关受体及信号通路研究

3.1EDA与整合素家族的相互作用整合素家族是位于细胞表面的FN的特异性受体，常与EDA+FN结合的受体有α9β1、α4β1、α4β7等整合素。

EDA与α9β1的相互作用通常发生在上皮细胞与血管内皮细胞上，介导细胞迁移与FN基质的构建，并促进淋巴管瓣膜发育。结肠癌、肺癌中皆发现EDA+FN通过与相邻癌细胞上的α9β1相互作用，来激活胞内FAK/Rac、PI3-K/Akt及ERK1/2等信号通路，促进上皮细胞-间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)，发挥诱导癌细胞分散、促进细胞迁移及侵入基底膜等生物学作用[9-10]。SW480细胞体外培养实验发现，EDA-α9β1作用可活化Wnt/β-catenin信号通路，促进CD133+/CD44+表达及细胞亚群的成瘤能力，从而促进肿瘤的发展[11]。

EDA与α4β7整合素受体结合主要参与、诱导成纤维细胞的分化，EDA+FN与α4β7相互作用增加SMA的表达，促使胶原蛋白沉积、细胞收缩，并激活局部黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)与MAPK-ERK1/2相关的信号通路[12]。抑制α4β7的表达则会阻碍EDA所引起的上述生物学作用。表明EDA与α4β7整合素的相互作用是诱导成纤维细胞分化不可或缺的环节。

EDA与α4β1相互作用可刺激p44/42 MAP激酶磷酸化，影响细胞黏附，促进细胞收缩，介导细胞迁移的速率，促进纤维连接蛋白的合成与沉积，促进组织纤维化的形成[13]。

3.2EDA-TLR4的相互作用EDA另外一个重要的受体是Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)，EDA活化TLR4后产生一系列生物学反应，如动脉粥样硬化血管重构、特异性细胞免疫应答、激活肥大细胞、促进中性粒细胞迁移与单核细胞中白三烯的合成等，从而使EDA+FN在炎症发生与免疫应答中发挥重要作用[1]。纤维蛋白EDA作为TLR4的内源性配体，具有高度的免疫原性，可携带抗原靶向到达表达TLR4的树突状细胞(dendritic cells，DC)，DC是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，TLR4识别EDA-抗原融合蛋白配体后，增强免疫原与DC的结合，激活下游核因子κB信号通路，促进人单核细胞系与DC中肿瘤坏死因子α和白细胞介素12的释放[14]。EDA-抗原融合蛋白增强DC的抗原提呈功能，诱导强烈的抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的免疫反应。

4　EDA的应用

4.1EDA作为诊断指标的研究在结肠癌、肝癌、甲状腺乳头状癌等恶性肿瘤的病理性进程中EDA表达量特异性升高，在肿瘤基质、肿瘤基底膜、肿瘤血管中大量存在，而在正常组织中未检测到EDA蛋白，肺癌、乳腺癌等癌症患者的血液样本中EDA+FN含量可高达20 mg/L，显示EDA可作为部分实体瘤发生与迁移时的诊断指标。研究结肠癌患者发现其肿瘤组织与血清中的EDA水平相对于早期大幅增加，EDA表达水平与肿瘤细胞分化程度、临床分期、淋巴结转移、化疗药物耐受性及结肠癌患者预后不良呈显著正相关[4,11]。EDA在鼻咽癌患者的血清与肿瘤组织中大量表达，肿瘤组织中的EDA水平与癌症细胞的分化程度与淋巴结转移密切相关[15]。另外，EDA在肝癌细胞及肿瘤附近的肝硬化中表达，但在非肿瘤性肝组织中不表达，肝细胞活组织检查中EDA的检测可作为肝癌诊断有用的辅助指标。

其他一些疾病中EDA也特异性表达，如成熟骨骼组织中检查不到EDA的表达，但在骨折创伤愈合组织与骨肉瘤细胞样品中却显示EDA+FN表达量显著增加，而在骨不愈合情况下则EDA表达量很低，显示EDA+FN可作为骨骼愈合、增生及骨肉瘤形成的特异性指标[16]。此外，EDA还可作为鉴别早期与晚期类风湿性关节炎，区分细菌性与病毒性脑脊髓膜炎的诊断指标[17]。

4.2以EDA抗体为载体的肿瘤生物靶向治疗肿瘤生物靶向治疗是将杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，限定在特定的靶细胞、组织或器官内而提高疗效，减少不良反应。EDA在一些浸润性肿瘤的新生血管及组织中特异性表达，研究针对EDA的高亲和力的抗体，可携带药物定位于肿瘤组织，可开发成靶向性抗肿瘤生物药物。Villa等[2]开发了3种针对EDA的3种单克隆抗体，即F8、B7与D5，其中F8与抗原亲和力最高，在生物分布实验中靶向性最好，临床实验证实F8在小鼠与人体中具有相似的亲和性，并且观察到EDA在实体瘤与血液恶性肿瘤中均高表达，这拓宽了抗体F8在靶向治疗中的适用范围，使得F8可作为有效的靶向抗癌治疗载体。F8抗体可以特异性识别高表达EDA+FN的血管与基质，实验证明F8-白细胞介素2-紫杉醇复合物可以有效抑制黑色素瘤的进展，提高自然杀伤细胞抗肿瘤活性，提高宿主反应，有效降低肿瘤负荷与肺转移结节数。该治疗法具有很高的靶向特异性，药物安全性好[18]。

4.3将EDA作为肿瘤治疗的靶点结肠癌细胞的增生引起EDA的上升，而EDA在促进恶性肿瘤的淋巴管生成中起重要作用，加速了肿瘤的转移，该研究表明EDA信号通路可作为抗肿瘤淋巴结转移的潜在治疗靶点[3]。研究显示内皮抑制素可以显著抑制结肠癌SW480细胞中EDA的分泌，并抑制淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cell,LEC)中整合素α9的表达，从而破坏LEC骨架抑制癌细胞中淋巴管的形成，抑制肿瘤的恶性进展[19]。若敲除EDA，则肿瘤干细胞相关标记物表达降低，细胞成瘤能力与迁移能力降低，已有证据表明阻断EDA与其整合素受体α9β1结合，可抑制肿瘤进展并减少直肠癌祖细胞生长[11]。EDA有望成为肿瘤治疗的靶点。

4.4EDA在其他疾病治疗中的研究Schwager等[20]构建了F8-白细胞介素10融合蛋白，可特异性识别炎症组织中的血管，与甲氨喋呤联合用于类风湿性关节炎的治疗，已进入一期临床研究阶段。Franz等[21]运用EDA抗体靶向治疗系统用于心脏疾患的诊治，F8可精确定位于EDA表达丰富的血管及纤维化区域，适用于抗体介导的慢性排斥反应的成像观察，用于疾病的早期诊断及靶向治疗。

在纤维化疾病研究中发现，EDA+FN是纤维化ECM的重要组成部分，TGF-β1诱导EDA-FN的生成作用是依赖于PI3-K/Akt信号通路及拼接调节蛋白SRp40的产生，针对mRNA转录前的剪接过程来跳过EDA外显子可能是攻克纤维化的一个有潜力的探索方向[22]。通过RNA干扰与阻断TLR4通路可以使EDA应答失效，也可以作为治疗硬皮症患者皮肤纤维化的选择方案[23]。

4.5以EDA为载体的疫苗研制EDA可以作为非常有效的蛋白质载体来携带抗原靶向到达DC，诱导DC成熟发挥治疗癌症、抗感染或抗病毒的作用。Femel等[24]构建细菌硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)与EDA的融合蛋白，Trx-EDA接种至乳腺癌小鼠体内可以产生高滴度的抗EDA抗体，增强肿瘤周边组织的巨噬细胞浸润，破坏肿瘤血管功能，降低小鼠肿瘤负荷及肿瘤转移率，显示Trx-EDA疫苗可以显著抑制原发性肿瘤的生长及转移，并抑制肿瘤复发。EDA受体TLR4可识别来源于微生物的具保守结构的分子并产生免疫细胞应答，EDA与乳头状病毒E7蛋白(human papil lomavirus E7,HPVE7)构建的融合蛋白(EDA-HPVE7)可以诱导抗肿瘤CD8+T细胞免疫，提示该融合蛋白具有研制成针对人类宫颈癌治疗性疫苗的巨大潜力[25]。将EDA与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)保守抗原p24偶联，协以TLR3的特异性配体poly(I:C)做佐剂，可以促进DC摄取递呈p24抗原，诱导高效特异的T细胞免疫应答，并诱导产生γ干扰素，提高对HIV蛋白的免疫原性，在HIV的疫苗研究中开启新的途径[26]。此外，EDA还可以与甲型肝炎病毒蛋白融合制备成抗甲型肝炎感染的疫苗。

5　展　　望

细胞EDA作为ECM的组成部分，参与了胚胎发育、创伤愈合、肿瘤发生、炎症反应等多种生理、病理进程，在疾病的诊断与治疗研究中越来越重要。目前报道的EDA分布大多位于血管壁、细胞、组织及基质中，另外有报道鼻咽癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等血浆或血清EDA+FN的表达量提高，但肿瘤种类与血液样本关联研究并不充分，EDA是否可作为新的血液检验指标用于肿瘤等疾病的诊断和治疗效果评价，尚需进一步探讨。EDA与不同肿瘤细胞的分化程度及纤维化程度的相关性也需要进一步的研究来发现。EDA作为载体在靶向治疗及预防研究中显示了巨大的应用潜力，但目前仅F8-白细胞介素10、甲氨喋呤联合用于类风湿性关节炎的治疗已经进入一期临床研究，其余的处于临床前试验水平，其临床方面的应用性研究仍需深入，并且有很大的开发空间。

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(本文编辑：许卓文)

[收稿日期]2015-10-12；[修回日期]2016-03-24

[基金项目]安徽省高校自然科学研究项目(KJ2015A420)

[作者简介]蔡晶晶(1983-)，女，安徽合肥人，安徽医学高等专科学校讲师，理学硕士，从事基因工程药物研究。 *通讯作者。E-mail:yanjigui1210@126.com

[中图分类号]R341.22

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)05-0617-04