杜岩岩，王　太，杨顺文，史小宁（甘肃省水产研究所/甘肃省冷水性鱼类种质资源与遗传育种重点实验室，甘肃 兰州 730030）

秦岭细鳞鲑物种有效性的探讨

杜岩岩，王太，杨顺文，史小宁
（甘肃省水产研究所/甘肃省冷水性鱼类种质资源与遗传育种重点实验室，甘肃 兰州 730030）

采用PCR技术获得细鳞鲑秦岭亚种25尾个体的线粒体DNA控制区598bp的序列，从GeneBank下载黑龙江流域的尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑的同源序列，以近缘物种哲罗鲑为外类群，构建了中国细鳞鲑属的分子系统发育树，并结合形态特征讨论了细鳞鲑秦岭亚种的有效性。遗传结构分析显示，秦岭亚种与黑龙江流域两种细鳞鲑之间以及后两种细鳞鲑之间的遗传距离分别为：0.0202，0.0207，0.0199，明显大于细鳞鲑属种内遗传距离：0.0023，0.0033，0.0091。以邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建的系统发育树表明，秦岭地区的细鳞鲑单独构成一个单系群，而黑龙江流域的两种细鳞鲑构成一个大的支系。以上结论证明了秦岭细鳞鲑已经达到了亚种水平的分化，该研究的结果支持形态分类上秦岭亚种的分类地位。

线粒体DNA控制区基因；分类地位；秦岭细鳞鲑

细鳞鲑（Brachymystaxlenok）隶属于鲑形目鲑科鲑亚科。在我国主要分布在东北地区黑龙江流域、绥芬河、图们江、鸭绿江；新疆的额尔齐斯河；河北省北部白河及滦河上游以及秦岭北麓渭河流域［1，2］。黄洪富等（1964）在渭河上游首次发现细鳞鲑的分布［3］，超出了张春霖（1957）和T.B.尼科里斯基（1960）等认为细鳞鲑只分布在苏联西伯利亚、中国东北以及朝鲜鸭绿江流域的范围。李思忠（1966）根据幽门盲囊、侧线鳞和最小性成熟年龄等形态学和生理学特征，把分布在秦岭地区的细鳞鲑定名为细鳞鲑的一个新亚种-秦岭亚种Brachymystaxlenok tsinlingensis Li，同时指出分布在黑龙江和新疆等地的细鳞鲑为指名亚种Brachymystax lenok（Pallas），并沿用多年。随后李国良（1986）将分布于河北北部的细鳞鲑也归属于秦岭亚种［4］。到了20世纪80年代，一些学者基于形态学（宋世良等，1984；王鸿媛，1988；秦树臻等，1989）对分布于黑龙江流域与分布于秦岭地区的细鳞鲑进行研究，指出分布于河北、甘肃与东北地区的细鳞鲑的侧线鳞、鳃耙数以及幽门垂数等主要性状上的差异并不明显，并用生化（秦树臻等，1989）的方法对河北、东北及甘肃采的细鳞鲑进行肌肉、脑及肝组织中的LDH进行同工酶谱分析，结果也显示并无明显差异，于是指出在我国分布的细鳞鲑只有一种，并无秦岭亚种的分化［5-7］。马波等（2005；2009）基于形态学与线粒体DNA控制区序列分析了黑龙江流域的细鳞鲑，并认为在黑龙江流域有两种，即钝吻细鳞鲑Blunt-snouted lenok与尖吻细鳞鲑Sharp-snouted lenok，但对于古黄河及秦岭等地区的细鳞鲑属于亚种分化还是属于地理种群分化没有进行分析［8-9］。夏颖哲等（2006）研究显示，分布于我国东部地区不同水系的细鳞鲑种群间产生显著的遗传分化，但未对是否存在秦岭亚种分化进行探讨［10］。

线粒体DNA（mtDNA）由于结构简单、进化速度快、几乎不发生重组、严格的母系遗传等特点，使得mtDNA成为探讨物种起源、系统发生和种内遗传分化的有效遗传标记［11］。mtDNA控制区（D-loop）为非编码区，选择压力小，所以比其他线粒体基因的进化速率更快［12］，因此，mtDNA控制区序列已经广泛应用于研究近缘物种、较远缘物种和快速形成的物种间系统进化关系与一些物种的有效性［13-15］。本研究测定了秦岭地区细鳞鲑的线粒体控制区的部分基因序列，结合GenBank中已知细鳞鲑属鱼类的基因序列进行分子系统关系研究，旨在为细鳞鲑秦岭亚种的分类学地位提供分子生物学依据。

1　材料与方法

1.1样品采集和DNA提取

细鳞鲑秦岭亚种主要分布于秦岭地区的渭河流域较大支流中。野外采集到25份尾鳍样品（表1），1尾采自甘肃华亭县境内的麻庵河（25号样品），2尾采自武山县境内的西河（23，24号样品），22尾采自张家川回族自治县内的马鹿河（1～22号样品），用无水乙醇固定带回实验室进行分析。主要形态学特征比较见表2。采用酚/氯仿法提取基因组DNA，从Genbank里下载细鳞鲑控制区的同源序列。

表1　样本的名称、来源及单倍型

表2　不同地区细鳞鲑主要形态比较

1.2 PCR扩增和序列测定

扩增mtDNA控制区序列的引物：正向引物为：LRBT-25：5′-AGA GCG CCG GTG TTG TAA TC-3′；反向引物为：LRBY-1195：5′-GCT AGC GGG ACT TTC TAGGGT-3′［16］。PCR反应体系为25 μL，其中包括1 UTaqDNA聚合酶（TaKaRa），1 μLdNTPs（2.5 mmol/L），5 μL 10xTaq buffer（TaKaRa，含Mg2+），两条引物（10 mmol/L）各1 μL，3 μLDNA模板，其余双蒸水补足。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环；反应结束后在72℃再延伸8 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送上海美吉生物工程公司纯化并测序，测序引物为扩增引物。

1.3数据分析

测序获得的序列通过Chromas 1.45软件获得原始序列数据，并进行人工校正；利用CLUSTAL X2软件对所有序列进行比对。用DnaSP 5.0软件计算单倍型数、单倍型多样性和核苷酸多样性等；运用Arlequin 3.1软件计算各种间的遗传分化指数FST值；用Mega 4.0软件统计碱基组成，用Kimura2-papamter模型计算单倍型及群体间的遗传距离，并以细鳞鲑的近缘物种哲罗鲑Hucho taimen（AY862359）为外类群，用邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建细鳞鲑属分子系统树，系统树中节点的自举置信水平应用自引导估计，循环次数为1 000次。

2　结果

2.1形态学比较

结合文献资料，由表2可以看出，李思忠以幽门盲囊、鳃耙数、侧线鳞和体长等可数可量性状将分布在秦岭地区的细鳞鲑作为新亚种的做法有欠缺依据不足，通过比较可以明显看出，五个地区的细鳞鲑在幽门盲囊、鳃耙数和侧线鳞等可数性状上呈连续分布，且相互之间重叠率较高，其中秦岭地区细鳞鲑的幽门盲囊（69-88）与滦河地区细鳞鲑幽门盲囊（66～93）完全重叠，侧线鳞数目（113～124）与额尔齐斯河流域细鳞鲑侧线鳞数目（113～129）完全重叠。在可量性状的比较中，仅以体长的数值作为分类依据是不可靠的，在鱼类中体长与年龄呈一种动态变化。表2中，秦岭渭河流域细鳞鲑的头长/眼径（4.09～4.53）、头长 /吻长（3.75～4.57）两个特征与额尔齐斯河流域细鳞鲑头长/眼径（4.0～5.3）、头长/吻长（3.6～4.6）范围值完全重叠。但秦岭地区细鳞鲑的体长/体高（3.48～3.73）与其他地区细鳞鲑的体长/体高（3.6～4.88）重叠比较低。

2.2序列变异特征

本研究中，所测的25个个体均获得线粒体控制区序列598bp，检测出3个单倍型，单倍型多样性为0.227，核苷酸多样性为0.00064。其中采集于武山县西河的2个个体检测出一个单倍型（WS），采集于张家川马鹿河的22个个体检测出 2个单倍型（ZJC和ZJCHT），采集于华亭县麻庵河的一个个体与张家川马鹿河其中一个单倍型共享（ZJCHT）。将从GenBank中下载的黑龙江地区水系的尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑共9个单倍型作为整体分析时，共检测出12个单倍型，本次所测的样品与其不存在单倍型共享。在598个位点中，存在29个变异位点（4.85%），其中包括19个简约信息位点（parsim-info sites）和10个单突变位点（singleton sites）。碱基组成分析显示，A、T、C和G碱基平均含量分别为31.9%、30.5%、22.9%和14.7%，其中A+T含量（62.4%）明显高于G+C含量（37.6%），表现出明显的反G偏倚。所有序列间没有出现缺失与插入，转换数4个，颠换数1个，平均转换与颠换数比值为4.3。用于分析的序列单倍型提交GeneBank中，登录号为KC136268～KC136270。

2.3序列遗传分析

以Mega 4.0软件基于Kimura 2-parameter模型的遗传距离计算见表3。由表3可以看出，钝吻细鳞鲑单倍型之间的遗传距离在0.0017～0.0034之间，最大值出现在单倍型BSW1与BSW2之间，种内平均遗传距离为0.0023；尖吻细鳞鲑单倍型之间的遗传距离在0.0017～0.0118之间，最大值出现在单倍型SHM1与SKL1之间，最小值出现在单倍型SWS1与SWS2之间，种内平均遗传距离为0.0091；钝吻细鳞鲑与尖吻细鳞鲑单倍型之间的遗传距离在0.0153～0.0239之间，种间平均遗传距离为0.0199。而秦岭细鳞鲑单倍型间的遗传距离在0.0008～0.0050之间，种群内平均遗传距离为0.0033，遗传分化均较小；而秦岭细鳞鲑与尖吻细鳞鲑单倍型之间的遗传距离在0.0153～0.0273之间，平均遗传距离为0.0207，与钝吻细鳞鲑单倍型之间的遗传距离在0.0171～0.0239之间，平均遗传距离为0.0202。运用Arlequin 3.1软件计算各种间的遗传分化指数FST值（对角线以上）分析显示，细鳞鲑三个种FST P值均小于0.01的检验水平，且秦岭地区的细鳞鲑与钝吻细鳞鲑的FST值最大（0.86111），与尖吻细鳞鲑之间以及尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑之间的数值为0.65234和0.65121，可以看出秦岭地区的细鳞鲑与黑龙江流域的细鳞鲑遗传分化明显。

表3　细鳞鲑属线粒体控制区序列的遗传分化指数（FST）和Kimura 2-parameter遗传距离（对角线及以下为遗传距离，对角线以上为遗传分化指数）

2.4系统聚类关系

以细鳞鲑近缘属哲罗鲑 （Hucho taimen，AY862359）为外类群，用Mega 4.0软件采用邻接法（NJ）法和最大简约法（MP）对尖吻细鳞鲑、钝吻细鳞鲑与甘肃地区的细鳞鲑的同源序列进行分子系统关系分析，两种方法构建的系统发育树的拓扑结构完全一致，区别在一些节点的支持率有所不同（图1）。图中显示所有的细鳞鲑个体的单倍型在分子系统树中构成一个大的分支，并明显的分成2个显著地独立进化分支，其中尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑的单倍型聚为一个进化分支，并有55%说明尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑的亲缘关系较秦岭细鳞鲑更近，而秦岭细鳞鲑的单倍型则独自构成一个节点支持率100%和99%进化分支。

3　讨论

亚种是某个种的表型上相似种群的集群，栖息在该物种分布范围内的次级地理区，在分类学上和该种的其他种群不同（Mayret al.，1991），这也可以认为亚种在分子水平上应该也是一个独立的进化单元［17］。李思忠（1966）在秦岭太白、周至等地采集了40尾细鳞鲑标本，通过与黑龙江流域细鳞鲑进行形态学比较认为是一个新亚种。这与马波等（马波等，2009）所指出分布于秦岭地区的细鳞鲑与黑龙江流域存在的尖吻和钝吻细鳞鲑对比的形态特征基本处于尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑的中间类型一致，而且为我国所特有。但综合文献报道，初步的形态学特征比较显示（表2），五个地区的细鳞鲑在可量可数性状上基本是连续的。但单独来看分布于秦岭地区与黑龙江流域的细鳞鲑，则秦岭地区的细鳞鲑在鳃耙数和头长/眼径两个特征上基本上介于黑龙江流域两种细鳞鲑之间，幽门盲囊数、体长/体高及体长/头长等特征明显低于黑龙江流域两种细鳞鲑，而头长/吻长则与钝吻细鳞鲑接近并明显大于尖吻细鳞鲑，这些特征的比较结果表明，分布于秦岭地区的细鳞鲑与黑龙江流域的两种细鳞鲑在形态上有明显的区别，这与李思忠把这两地区的细鳞鲑比较得出的结论一致。但是，秦岭地区细鳞鲑与滦河、鸭绿江和额尔齐斯河三个地区的可数可量性状较近，且在部分性状有完成重叠的现象，但是在体长/体高这一可量性状上可明显区别于这三个地区的细鳞鲑。本研究以线粒体DNA控制区部分基因序列对采自秦岭地区与黑龙江流域的细鳞鲑构建的NJ树和MP树进一步显示，尖吻细鳞鲑与钝吻细鳞鲑一起构成姐妹群，而采自秦岭地区的25尾细鳞鲑在系统发育上具有单系性，独立构成一个独立的进化分支，且支持率达99%和100%，这与大口黑鲈［18］、虎［19］、林蛙（Rana altaica）［20］等亚种在系统树中都以单系出现相似。但是也有很多传统意义上的亚种没有形成一个独立的进化单元［21，22］。

图1通过邻接法（NJ）和最大简约法（MP）构建的细鳞鲑属线粒体控制区序列的系统发育树

除了在进化树上形成为单系外，物种内不同地理种群之间的分化程度是否达到亚种的水平还要看各分支之间的遗传距离是否差异显著［23］。细鳞鲑秦岭亚种与尖吻细鳞鲑（平均遗传距离0.0207）和钝吻细鳞鲑（平均遗传距离0.0202）之间的遗传距离都远远大于群体内的平均遗传距离（0.0033，0.0023，0.0091），且与已报道的基于D-loop区的黑龙江流域两种细鳞鲑之间的遗传距离0.0190（马波等，2009）相近。由此可见分布于秦岭地区的细鳞鲑与分布于黑龙江流域的细鳞鲑之间的遗传分化明显，并且已经达到了亚种的分化水平。因此，本研究的结果从分子角度支持传统形态分类上的秦岭细鳞鲑亚种的分类地位。对分布于河北、辽宁及新疆等地区的细鳞鲑是否是秦岭亚种或其他，需采样对其进一步验证。

由于NJ和MP系统发育树的拓扑结构相同，此处仅显示NJ系统发育树，节点上数据从左到右为MP、NJ的BP值（%，仅显示≥50%的值）。

细鳞鲑属鱼类的现代分布中心是北冰洋流域的西伯利亚地区，经推断细鳞鲑的起源中心也应该是西伯利亚地区（秦树臻等，1989）。李思忠（1984）认为，我国的鲑科鱼类都是冰川期的残留鱼类。从约距今260万年前的第四纪开始，我国曾有四次大的冰川进退（李四光，1972）。起源与分布在西伯利亚地区的细鳞鲑，随着冰期与间冰期的反复，沿日本海向南扩散至黄海和渤海，由于鲑科鱼类朔河回游产卵繁殖的需要，沿黄河古道朔河而上，洄游至渭河流域进行产卵繁殖，随着冰川的消失，大部分种群返回到原发源地，而一部分被滞留在渭河流域的高山溪流里，并被长期封闭在那些地区。若以每百万年1%序列分歧计算［24］，则秦岭细鳞鲑与黑龙江流域的细鳞鲑的遗传分化大约始于200万年前，即从第四纪初的早更新世冰期就被封闭在秦岭地区的溪流里。海洋中的鱼类由于水域相通，群体间可以产生频繁的基因交流，遗传分化一般都比较低，而不同水系的淡水鱼类种群间由于受海洋或者山系的隔离，基因分化程度一般都比较高［25］。鉴于秦岭地区的水系与黑龙江流域的水系完全隔离的格局，秦岭地区渭河水系的细鳞鲑与黑龙江流域细鳞鲑之间基本上没有基因交流，完全生殖隔离，分布于这些水系的细鳞鲑不断的积累具有种群特异性的遗传变异，可能在形态特征上还没有表现明显，但在分子数据方面已经表现出了很大的差异，并已经达到了亚种的分化。

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（编辑：高真贞）

S965.232

A

1006-799X（2016）11-0122-05

项目名称：国家自然科学基金项目（31460560）。

杜岩岩（1983-），女，山东临沂人，助理工程师，主要从事鱼类种质资源保护研究。