曲　哲，刘　佩，姚　园



MMP-9在心肌缺血再灌注中的作用和机制研究

曲哲，刘佩，姚园

武汉大学人民医院(湖北武汉 430060)，E-mail：yinh74@126.com

摘要：目的探讨血清基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在心肌缺血再灌注中的表达和作用机制。方法建立大鼠急性心肌缺血再灌注模型，构建MMP-9 siRNA慢病毒，并分为对照组、缺血再灌注(I/R)组、I/R+control-siRNA组、 I/R+MMP-9-siRNA组。观察并记录术后28 d各组大鼠生存情况，Western Blot 检测在大鼠 I/R术后1 d，7 d，14 d，28 d心肌中MMP-9的表达；M型超声评价各组大鼠心功能改变；Real time PCR法检测干扰素-γ(IFN-γ)、 白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的变化。结果I/R+ MMP-9 siRNA组大鼠生存率达80%，生存率显著提高，与I/R组比较，具有统计学意义(P<0.05)。I/R组和I/R+control-siRNA组左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)以及左心室质量指数(LVMI)增加(P<0.05)，对I/R组大鼠进行MMP-9 siRNA干预后，可见3个指标减少，与I/R组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。I/R术后，MMP-9蛋白表达明显增加，与术后1 d比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。当缺血再灌注时IFN-γ、IL-6、TNF-α急剧增加(P<0.05)，MMP-9 siRNA干预后，可见IFN-γ、IL-6、TNF-α不同程度的减低，与I/R组大鼠比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论以MMP-9 siRNA作为靶标可减轻缺血再灌注损伤和心室重构，改善心室功能。

关键词：心肌缺血再灌注；基质金属蛋白酶-9；siRNA；炎性因子

急性心肌梗死(AMI)是临床上很常见的急危重症，随着现代生活节奏的加快，饮食习惯的改变以及人口老龄化和社会、心理等因素的影响，目前我国急性心肌梗死的发病率高达45/10万～55/10万[1-2]。急性心肌梗死可导致较长时间心肌组织缺血，当重新恢复血液灌流时，其造成冠脉流量下降，收缩功能降低，血管反应性改变，进而造成更为明显和严重的再灌注损伤和心肌功能障碍，称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[3]。MIRI过程包括细胞外基质的重构，使得动脉扩张来维持血管正常的张力。激活的驻留成纤维细胞和招募的单核/巨噬细胞释放细胞因子和生长因子影响细胞外基质的产生和降解。细胞外基质的降解组分进一步招募更多的炎性细胞到损伤组织，其中基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)是一组依赖于锌离子的以降解细胞外基质成分作为底物的蛋白水解酶，心肌细胞、心肌成纤维细胞和巨噬细胞均能分泌MMPs[4-5]。本研究拟通过心肌缺血再灌注大鼠模型心肌MMP-9的表达，分析其在缺血再灌注损伤中的作用和机制，为将MMP-9作为诊断、治疗和评估预后的生物标记物提供依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器PVDF膜购自Pall Life Sciences公司，Western blot相关化学试剂购自上海碧云天生物技术有限公司，ECL试剂购自Amersham Biosciences公司，兔抗鼠 MMP9单抗，羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG二抗购自美国Cell signaling公司。RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，lipo2000试剂购自美国Invitrogen公司。手术器械和显微镜购自上海医用仪器厂。酶标仪购自美国BD公司。DNA扩增仪购自美国PE Gene Amp PCR System 2400。其他常用试剂购自上海生工生物有限公司。

1.2实验动物选取清洁级 Wistar 大鼠80只，雄性，鼠龄6周～8周，体重 230 g±20 g。由本院实验动物中心提供。严格遵守无特殊病原菌(SPF)要求分笼饲养。本研究经医学伦理委员会批准进行。

1.3方法

1.3.1动物分组实验动物常规适应性饲养1周后进行实验。取同批次同周龄的大鼠按照体重标记后，以随机数字表法将大鼠随机分为4组，每组20只。 对照组； 缺血再灌注(I/R)组； I/R+control-siRNA组；I/R+MMP-9-siRNA组。

1.3.2大鼠急性心肌缺血再灌注模型麻醉后，将大鼠仰卧位固定四肢于操作台上。胸前区脱毛，手术区消毒，经口明视下气管插管，呼吸机辅助呼吸(潮气量4 mL 、呼吸频率80 次/min)。经胸骨左侧第四肋间开口，钝性分离皮下肌肉，暴露心脏。以7-0 尼龙线穿过左心耳下缘(1～2)mm 处的2/3 心肌层，结扎左侧冠脉，实验过程中心电图实时监测，以大鼠心肌颜色变白且心电图ST 段持续弓背抬高(>1/2 R波)呈单峰曲线作为模型成功标志。结扎45 min后，去除塑料管，撤除结扎线。以心肌恢复红润且ST 段下降作为再灌注模型成功标志。

1.3.3MMP-9 siRNA慢病毒构建及包装针对基质金属蛋白酶8靶基因设计siRNA序列，序列由Santa Cruz合成，序列号sc-35950，由3个靶向特异性的含20～25碱基的siRNA构成；control siRNA是非靶向20～25 nt siRNA，序列号 sc-37007。合成小发卡RNA(short hairpin RNA，siRNA)结构的DNA，与经AgeΙ和EcoRΙ酶切的pSIL-RFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞，构建成携带MMP-9-siRNA慢病毒质粒载体(pSIL-RFP/MMP9-siRNA)，PCR及测序鉴定后，Western blot筛选出携带最佳siRNA的慢病毒质粒载体，并利用慢病毒包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)将其制备成MMP8-siRNA慢病毒，并测定病毒滴度为1×1010pfu/L。PCR和DNA测序证实合成的含基质金属蛋白酶8短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pSIL-RFP载体，表明实验成功构建基质金属蛋白酶8的RNA干扰慢病毒表达载体。

1.3.4Western blot检测MMP-9蛋白表达变化Western Blot 检测在大鼠 I/R术后1 d，7 d，14 d，28 d心肌中MMP-9的表达。取心肌提取蛋白：加裂解液，在冰上裂解并研磨15 min～30 min，5 s × 4次超声破碎细胞，4 ℃离心15 min，转移上清至新的Ep 管中，蛋白定量后于-20℃保存，用于Western blot实验。分离蛋白利用10% SDS-PAGE电泳，并将胶用半干转膜法转移至PVDF膜，去除非特异性背景利用室温，5% 脱脂奶粉作用，2 h。分别加入一抗1∶1 000 稀释的HPV16 E7单抗，摇床，4℃，过夜，PBST洗涤，室温，避光条件下加入1∶2 000羊抗兔二抗，孵育30 min，PBST洗涤，化学发光剂显色1 min，X片曝光成像，观察结果。利用蛋白图像处理系统软件和Quantity one软件分别扫描X胶片和条带密度测定。分别重复实验四次，统计分析。

1.3.5各组大鼠形态学和生存状态分析观察各组大鼠形态学变化，记录大鼠生存状况，并于术后28 d记录各组大鼠生存率。

1.3.6评价各组大鼠I/R术后心功能改变分别于术后28 d利用M型超声评价各组大鼠I/R术后心功能改变，左心室质量指数，心室收缩及舒张内径。仰卧位固定实验大鼠，右手持15L8超声探头，将超声探头置于大鼠胸骨旁，取胸骨旁左室短轴乳头肌水平切面，获得清晰2D图像后，转换M型超声心动图，转动轨迹球，测量左室舒张末内径(LVEDD)和左室收缩末内径(LVESD)，并根据公式计算左心室质量指数。

1.3.7Real-time PCR检测大鼠干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、TNF-α表达变化依据基因序列合成引物，引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成(见表1)。采用Trizol试剂提取各组心肌细胞，根据试剂盒说明，进行DNA反转录合成。对目的基因进行Real-time PCR检测。反应条件：55℃ 1 min，92 ℃ 30 s，58℃ 45 s，72 ℃ 35 s，共进行35个循环。进行数据收集，利用PCR反应仪软件，将GAPDH为参照，根据荧光定量，计算出所有样品以及标准品的起始循环数(CT)，以标准品CT值为依据，绘制出标准曲线，再根据2-△Ct法进行半定量分析。

表1　引物序列

2结果

2.1各组大鼠大体观察和生存率分析对照组大鼠仍保持正常状态，皮毛柔顺光滑，发育正常，饮食、精神状况正常，反应灵敏；缺血再灌注(I/R)组大鼠于术后出现精神萎靡不振，反应迟缓，毛发稀疏光泽度减少，饮食不佳，且出现发绀以及肢端水肿；I/R+control-siRNA组大鼠状态类似于缺血再灌注组大鼠；而I/R+ MMP-9 siRNA组可见MMP-9 siRNA干预后，大鼠饮食恢复较好，精神状况、活动状况随着干预时间的延长而转好，皮毛较对照组光滑，且稀疏程度减少。I/R+MMP-9 siRNA组大鼠生存率达80%，生存率显著提高，与I/R组比较，具有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2　各组大鼠生存率分析

2.2MMP-9siRNA对I/R大鼠术后心功能改变的影响利用M型超声评价在术后28 d对各组大鼠心功能进行评估，发现在I/R后，心脏功能发生明显改变，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径在术后出现增加，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，而control-siRNA组两个指标也显著增加，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，当对I/R组大鼠进行MMP-9siRNA干预后，可见LVESD和LVEDD出现减小，与I/R组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。同样，左心室质量指数(LVMI)出现与LVESD和LVEDD相似的变化，即I/R组和control-siRNA组显著增加，与对照组比较有统计学意义；而经MMP-9siRNA干预后，可见降低，与I/R组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明I/R后心功能出现显著降低，而经MMP-9- siRNA干预可显著改善心功能指标。详见表3。

表3　MMP-9siRNA干预后对I/R大鼠心功能的影响(±s)

2.3MMP-9在I/R大鼠心肌中的表达变化提取心肌组织蛋白，利用Western Blot 检测在大鼠心肌中 I/R术后1 d，7 d，14 d，28 d MMP-9的表达变化。在大鼠心肌中 I/R术后，MMP-9蛋白表达明显增加，术后14 d和28 d表达增加明显，与术后1 d比较，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，说明心肌组织中MMP-9蛋白的表达在缺血再灌后随着时间的延长而增加(见图1、图2)。

图1　MMP-9在I/R大鼠心肌中的表达变化

注：与术后比较，*P<0.05，**P<0.01

2.4MMP-9对I/R大鼠炎性因子表达的影响进一步利用Real time PCR法检测干扰MMP-9表达对I/R大鼠炎性因子表达的影响。当缺血再灌注时IFN-γ、IL-6、TNF-α急剧增加，与对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，MMP-9- siRNA干预后，可见IFN-γ、IL-6、TNF-α不同程度的减低，与I/R组大鼠比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。详见图3～图5。

注：与对照组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05。

注：与对照组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05。

注：与对照组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05。

3讨论

心肌缺血再灌注损伤，可出现一系列治疗后病情恶化现象，尤其表现在急性心肌梗死经PCI治疗后，可以表现为心功能不全、严重心律失常、心源性休克、心功能衰竭、心源性猝死等。心肌缺血再灌注损伤可进一步发生心脏重构，甚至引起心力衰竭、心脏破裂等严重并发症[6-8]。 心肌缺血再灌注损伤发生的相关机制尚未完全阐明，同时如何减轻心肌缺血再灌注损伤也成为目前医学界研究热点之一[9]。关于MIRI发生机制的研究众多，目前主流有三个学说，包括白细胞损伤学说、钙离子学说、自由基损伤学说，由炎症反应，钙离子的参与，以及细胞损伤坏死等造成自由基损伤，从而引起触发级联放大式效应，引起一系列病理生理过程[10-12]。

众多基质金属蛋白酶家族的表达和活性均有所变化，例如在心肌梗死中可见到MMP-2的含量增加，而其活性也明显提高，并证明其中发挥重要病理作用。有实验表明，在动物心肌梗死模型以及心肌梗死发生左室重构的病人中，可以见到MMP-1、MMP-2、MMP-3的表达增加，活性亦有所增强。研究发现，MMP-1表达水平在高血压心肌肥厚组与非肥厚组进行比较明显降低，而且MMP-1活性在心肌肥厚的高血压病病人中降低的更明显[13]。本研究证实，在I/R损伤动物模型中，MMP-9的表达增加，且随着损伤的时间延长而增加更加明显。MMP-9的表达增加，大鼠死亡率也明显增加，经MMP-9siRNA干预后，可见大鼠精神状态转好、饮食恢复较好，活动能力增强，而死亡率与I/R组比较有明显减少。

细胞外基质ECM的合成与降解保持动态平衡，而在研究中证实基质金属蛋白酶家族和/或 TIMP 表达和活性改变，平衡被打破，ECM 过度沉积过多，导致心肌间质纤维化和血管重塑，血管周围纤维化，因此使心室心肌顺应性进一步下降，心肌收缩功能下降，导致心脏衰竭的发生[14]。本研究结果证实，缺血再灌注大鼠心脏功能发生明显改变，左室收缩末期内径和左室舒张末期内径在缺血再灌注术后出现增加，当对I/R组大鼠进行MMP-9- siRNA干预后，可见左室收缩末期内径和左室舒张末期内径出现减小，而代表心肌功能改变的左室质量指数显著增加，结果与以往研究一致，说明缺血再灌注心功能出现显著降低。但经MMP-9- siRNA干预可显著改善心功能指标。

心肌损伤后炎症以及免疫应答均参与其中，因此可在心肌缺血再灌注损伤过程中发挥作用。炎症过程中巨噬细胞可通过吞噬坏死细胞以及组织碎片，或直接分泌细胞因子、生长因子等调节其他细胞参与免疫应答以及心肌缺血再灌注损伤的调节，再胶原合成、分泌、瘢痕形成、炎症发生等。基质金属蛋白酶家族以及组织型基质金属蛋白酶抑制剂也主要作用在细胞外基质，参与合成分泌炎性因子等作用，而炎性细胞因子分泌增加，促进炎症发生，导致细胞外基质的大量损失[15-16]。本研究证实当缺血再灌注时IFN-γ、IL-6、TNF-α急剧增加，MMP-9- siRNA干预后，可显著抑制IFN-γ、IL-6、TNF-α的分泌，说明干预MMP-9有利于减轻心肌缺血再灌注引起的炎症反应。

本研究证实以MMP-9为靶点，进行 siRNA干预，可减少炎性因子分泌，减轻炎症反应，可能对抑制缺血再灌注的损伤，逆转血管重构有较好作用，为临床预防、诊治心肌缺血再灌注损伤的分子靶点选择提供理论依据。

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(本文编辑王雅洁)

中图分类号：R542.2R285.5

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.014

文章编号：1672-1349(2016)13-1483-05

(收稿日期：2015-08-12)

The Effects and Mechanisms of MMP-9 on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

Qu Zhe，Liu Pei，Yao Yuan

Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060，Hubei，China

Abstract：ObjectiveTo explore the expression， effects and mechanisms of matrix metallo proteinases 9(MMP-9)on myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI).Methods Acute myocardial ischemia reperfusion rat models and MMP-9 siRNA lentivirus were established.The animals were divided into control group，ischemia reperfusion group(I/R group)，I/R+control-siRNA group，I/R+MMP-9-siRNA group.The survival rate was observed after 28 days of operation.The changes of heart function were analyzed by M type ultrasonics.MMP-9 expression in the myocardium after 1 d，7 d，14 d，28 d after operation was detected by western blot.Real-time PCR was used to detect M1 macrophage markers interferon-gamma (IFN-γ)，interleukin-6(IL-6)，tumor necrosis factor-alpha (TNF-α).Results The survival rate in I/R+MMP-9 siRNA group significantly increased compared with I/R group (P<0.05).LVESD and LVEDD in I/R group and I/R+control-siRNA group increased with significant difference compared with the control group(P<0.05).After MMP-9 siRNA treatment，LVESD and LVEDD reduced significantly compared with I/R group(P<0.05).Similar changes could be seen in left ventricular mass index(LVMI).MMP-9 protein increased significantly after 14 days and 28 days of operation (P<0.05).The levels of IFN-γ，IL-6，TNF-α increased dramatically in I/R group and reduced at different degrees after MMP-9 siRNA treatment compared with I/R group (P<0.05).Conclusion MMP-9 can participate in MIRI and ventricular remodeling.MMP-9 siRNA can reduce the cardiac injury and improve ventricular function.

Key words：myocardial ischemia reperfusion injury；matrix metallo proteinases 9；siRNA；inflammatory cytokines