刘妙娜刘琢冰郑　娟谢　星吴伟刚（.深圳市第三人民医院　深圳　582；2.广东医学院附属深圳第三人民医院　深圳　582；3.赣南医学院　赣州　34000）

·实验研究·

SIRT6在原发性肝癌中的表达变化与抑瘤机制分析△

刘妙娜1刘琢冰2郑娟2谢星3吴伟刚（11.深圳市第三人民医院深圳518112；2.广东医学院附属深圳第三人民医院深圳518112；3.赣南医学院赣州341000）

SIRT6是Sirtuin家族的组成部分，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的组蛋白去乙酰化酶。SIRT6是肝脏葡萄稳态主调节者，通过对胰岛素/IGF1样信号（IIS）途径的影响，基于多个网络调控机制，实现对葡萄糖代谢的影响，对人体生命维系和控制肿瘤产生作用。本文笔者以SIRT6为出发点，分析其在原发性肝癌中的表达变化与抑瘤机制。

SIRT6原发性肝癌 表达变化 抑瘤机制

1材料与方法

1.1材料与试剂：TUNEL（试剂盒）、蛋白酶/磷酸酶抑制剂、活化型半胱天冬酶-3抗体、ERK1/2抗体、总ERK1/2抗体、U0126、ECL试剂盒、二氯氢化荧光素（DCF）、4%多聚甲醛、0.3%过氧化氢液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、总蛋白提取试剂盒等。

1.2细胞株和质粒载体：一方面，通过已构建好的Ad-SIRT6真核质粒载体和Ad-SIRT6-shRNA质粒载体进行试验。另一方面，HepG2细胞为细胞株，在联合Ad-SIRT6-HepG2与Ad-GFP-HepG2细胞的基础上，进行培养繁殖。

2 SIRT6发挥肝癌抑瘤作用机制实验研究

2.1分析TUNEL：（1）将无菌平板片放置于96孔板中，清洗干净，利用多聚赖氨酸覆盖浸润后倒除，达到固定细胞的效果。（2）待平板片干后，马上用离子水清洗，采取自然通风干燥方式。（3）在96孔板的无菌平玻上接种HepG2细胞。（4）培养约至细胞铺满70%，利用Ad-SIRT6质粒和Ad-GFP质粒，转染HepG2细胞，于6h后继续培养。（5）待孵育生长24h后，利用PBS将平板内细胞洗2次，每次以3min为标准，放置于通风位置2～3min，待其干燥。（6）通过4%多聚甲醛对细胞进行处理，基于室温条件，固定25min。（7）以室温条件为基础，利用PBS液冲洗玻片5min，以2次为标准。（8）在室温条件下，将玻片细胞浸入透化剂0.2%TritonX-100中，通透5min。（9）在常温条件下，利用PBS液冲洗5min，以2次为标准，放置于干燥状态。（10）利用平衡液将细胞覆盖，在室温条件下，平衡5min，基于冰上预置前提，续各酶。将100μL对照平衡液添加至阴性对照组，将100μLrTdT反应混合物添加至实验组。基于37℃以内，孵育60min，且允许末端标记反应发生。利用PBS液冲洗4次，基于常温条件，在0.3%过氧化氢中浸泡5min，促使内源性过氧化物酶得以消除，再用PBS清洗2次。（11）在玻片中添加新鲜配制的DAB100μL.于37℃避光条件下，孵育1h，直到玻片显示为棕色为止，用离子水进行2次冲洗，每次以30min为标准。（12）通过荧光显微镜，对染色细胞进行观察，TUNEL阳性细胞（绿色）则为凋亡细胞，并计数。

2.2 Western blot法检测HepG2细胞中的Caspase-3蛋白：转染成功的Ad-SIRT6-HepG2细胞与Ad-GFP-HepG2细胞为受检样本，分别1×107取用于试验。大致步骤涉及以下几点：提取细胞总蛋白、利用BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定、SDS-PAGE电泳、免疫检测以及化学发光等。其中，Caspase-3抗体和相关二抗为所有抗体。

2.3测量细胞内活性氧：第一，接种已转染细胞，基于经消毒的96孔板，利用移液枪，缓慢接种Ad-SIRT6-HepG2细胞与Ad-GFP-HepG2细胞。5×104个细胞/孔为标准。第二，在孵育过夜条件下，离心96孔板，用PBS清洗2次，切勿洗掉细胞。第三，DCFH孵育，以100μMDCFH为依据，在37℃避光条件下，孵育1h。第四，处理，孵育结束后，利用PBS清洗2次。第五，检测，利用荧光酶标仪对荧光进行检测。

2.4 U0126对Ad-SIRT6-HepG2细胞增殖的影响：将Ad-GFP 与Ad-SIRT6转染HepG2细胞接种至48孔板上，在孵育过夜基础上，运行连接。第二日，待细胞血清饥饿8h后，在培养基中添加FBS，再添加U0126，共同培育。以12h、24h、36h以及48h为基点，分别添加10μL的CCK-8溶液于细胞内，共同孵育2h，并基于3450nm光密度条件，进行分析。

3统计学方法

利用SPSS20.0软件对本次研究所有数据进行分析，用（±s）表示计量资料，t检验，X2检验计数资料的比较，差异具有统计学意义用P＜0.05表示。

4结　果

4.1 SIRT6过表达诱导HepG2细胞凋亡：基于Ad-SIRT6转染条件，HepG2细胞组凋亡细胞明显，相较Ad-GFP，差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）。如表1所示。在Ad-SIRT6转染作用下，HepG2细胞检测到了凋亡细胞（TUNEL阳性细胞，呈绿色，如图1A所示），提示SIRT6过度表达诱导肝细胞凋亡，差异显著，见柱状图（图1B）。

表1 Ad-SIRT6与Ad-GFP TUNEL分析结果对比

4.2 SIRT6过表达肝细胞降低氧化应激：对比Ad-GFP与Ad-SIRT6 DCF法测ROS，差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）。如表2所示。基于DCF检测结果表明，过度表达SIRT6能降低HepG2细胞中的ROS水平，如图2所示。

表2 Ad-GFP与Ad-SIRT6 DCF法测ROS结果对比

4.3 U0126抑制ERK1/2结果：对比U0126抑制ERK1/2结果，差异显著，具有统计学意义（P＜0.05）。如表3所示。如图3所示，U0126显著减弱SIRT6对干细胞生长的抑制效果，可见，SIRT6在抑制ERK1/2信号转导通路的基础上，对肝癌细胞生长具有抑制效果。

表3 U0126抑制ERK1/2结果对比

5讨论

本次实验采用TUNEL试验方式，在检测SIRT6对肝癌细胞凋亡影响作用的基础上，探究caspase3蛋白表达水平，结果显示，SIRT6过表达具有激活活化型caspase3蛋白表达的作用，能够促使癌细胞凋亡。同时，在测量细胞内活性氧的基础上，探究U0126对Ad-SIRT6-HepG2细胞增殖的影响。

细胞凋亡，最早见于1972年，由英国Kerr提出［1］，指活体细胞基于某种生理因素或病理因素条件，通过机体信号系统调控，体现的主动型细胞死亡现象，亦被称为细胞程序性死亡［2］。其中，针对细胞凋亡，主要设计两个途径：一是死亡因子受体配体通路，Fas与Fasl相结合，并募集FADD，形成三联复合体，即Fasl-Fas-FADD，促使caspase8、caspase3等被激活，迫使细胞凋亡［3］。二是TNER死亡通路，基于TNER1和TNER2介导作用，发挥TNF的生物活性，通过结合，募集细胞内TNER相关结构域蛋白，促使caspase8、caspase3等被激活，达到细胞凋亡目的［4］。

本次研究，初步证实了SIRT6在HepG2肝癌细胞株过度表达具有较为明显的抗肿瘤作用，该作用在诱导细胞凋亡的基础上，抑制ERK1/2信号通路。同时，SIRT6过度表达能够降低HepG2肝癌细胞ROS水平，证明SIRT6抗氧化作用较强。总之，SIRT6对肝癌细胞生长的调控，有助于加深对感染的理解，实现对肝癌的有效干预，促使肝癌控制进入新的发展阶段。

［1］喻明慧，陈帆，魏清.腹腔镜下胆囊切除术患者麻醉苏醒期的护理探讨［J］.中国伤残医学，2013，9：326-327.

［2］张智高.SIRT6在原发性肝癌中的表达变化及其抑瘤机制的研究［D］.山东大学，2014.

［3］刘毅.SIRT3在原发性肝癌中的表达及其抑瘤作用的研究［D］.中南大学，2012.

［4］张弓.EphA7在原发性肝细胞癌中的表达及其体外抑制研究［D］.郑州大学，2010.

△深圳市科技创新委基础研究知识创新计划JCYJ20130329171031740。

Analysis of SIRT6 in primary hepatocellular carcinoma and the expression of tumor suppressor mechanism

Liu Miaona1Liu Zhuobing2Zheng Juan2Xie Xing3Wu Weigang1（1.Department of Pharmacy，the Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518112；2.Shenzhen Third People’s Hospital Affiliated To Guangdong Medical College，Guangdong Shenzhen 518112；3.Gannan Medical University，Ganzhou，Jiangxi Province，341000）

SIRT6 is part of the sirtuin family，nicotinamide adenine dinucleotide（NAD+）-dependent histone to acetylase.SIRT6 is grape homeostasis in liver as the main controller，through the effect of insulin-like/IGF1 signal（IIS）pathway，based on multiple network regulation mechanism to achieve effects on glucose metabolism，to human life and maintain and control tumor effect.In this paper，the author will SIRT6 as a starting point，analysis the in primary hepatocellular carcinoma and the expression changes of and mechanism of inhibiting tumor.

SIRT6 Primary liver cancer Expression change Mechanism of inhibiting tumor

R735.7

B

1672-8351（2016）08-0108-02