宋亚光　魏子淳　王　宇　徐熙萌　饶晨旭　谭会兵　霍博雅

(锦州医科大学，辽宁　锦州　121001)



针灸预处理对成年和老年甲醛致痛大鼠脊髓NO分布和c-fos表达的影响

宋亚光魏子淳王宇徐熙萌饶晨旭谭会兵霍博雅1

(锦州医科大学，辽宁锦州121001)

〔摘要〕目的比较成年和老年大鼠对炎症性疼痛反应的差别，以及针灸预处理对成年和老年甲醛致痛大鼠脊髓一氧化氮(NO)分布和c-fos表达的影响。方法将4月龄和21月龄雄性SD大鼠分别随机分为对照组(不做任何处理)、甲醛组(仅注射甲醛)、针灸足三里穴+甲醛组(针灸足三里穴后注射甲醛)、针灸非穴位+甲醛组(针灸非穴位后注射甲醛)，每组6只大鼠。针灸处理后，除对照组外，其余各组于针灸位点同侧足底注射甲醛。观察大鼠行为学反应，记录甲醛注射后1 h内的缩足次数和舔(咬)足时间，1.5 h后灌流取脊髓第4腰髓至第5腰髓节段，采用酶组织化学染色和免疫组织化学染色法检测脊髓NO的分布和c-fos的表达。结果对照组NO数量较低，且老年大鼠脊髓背角NO数量低于成年大鼠(P<0.01)；Fos免疫阳性神经元基础水平较低，且在成年和老年大鼠间无差异(P>0.05)；成年和老年大鼠脊髓未发现NO和Fos双标阳性神经元。甲醛组老年大鼠继发疼痛时相的缩足次数高于成年大鼠(P<0.05)；与对照组比较，NO阳性神经元、Fos免疫阳性神经元和二者双标阳性神经元数量在成年和老年大鼠脊髓均增加(P<0.01)，且老年大鼠的NO阳性神经元(脊髓背角，P<0.05；中央管，P<0.01)和Fos免疫阳性神经元数量(P<0.01)高于成年大鼠。针灸足三里穴+甲醛组成年和老年大鼠继发疼痛时相的缩足次数(P<0.01)和舔(咬)足时间(成年，P<0.05；老年，P<0.01)低于甲醛组；成年和老年大鼠脊髓NO阳性神经元、Fos免疫阳性神经元和二者双标阳性神经元数量均低于甲醛组(P<0.01)；且老年组NO阳性神经元和Fos免疫阳性神经元数量较甲醛组下降的幅度高于成年组大鼠(P<0.01)。针灸非穴位+甲醛组成年和老年大鼠继发疼痛时相的缩足次数、舔(咬)足时间、NO阳性神经元、Fos免疫阳性神经元和二者双标阳性神经元数量与甲醛组比较无差异(P>0.05)。结论老年大鼠对炎症性疼痛的反应强于成年大鼠，针灸预处理足三里穴可以提高大鼠痛阈，减轻疼痛反应，降低脊髓NO的数量和c-fos的表达，且对老年大鼠的作用优于成年大鼠。

〔关键词〕针灸预处理；衰老；一氧化氮(NO)；c-fos

研究报道，针灸足三里可有效抑制甲醛诱导的疼痛效应，且镇痛作用显著〔1〕。这种效应可能与脊髓疼痛相关基因的转录被抑制有关，例如即早基因c-fos〔2〕。当有害信号传入脊髓，原癌基因c-fos及其蛋白产物Fos迅速表达并持续较短时间。作为对皮肤传入有害刺激的应答，c-fos在脊髓神经元的表达已经被作为反映疼痛强度的指示器。一氧化氮(NO)可作为第二信使诱导c-fos表达，通过外周机制调节脊髓伤害性刺激，抑制NO的生成，具有显著的抗疼痛作用。一氧化氮合酶(NOS)是生成NO的关键酶。神经系统中的还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脱氢酶(NADPH)和NOS是同一种酶，目前多采用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原酶(NADPH-d)组织化学染色标记NOS来确定NO在神经元的分布。研究发现，足底甲醛注射可引起脊髓背角NADPH-d阳性神经元数量增加和Fos免疫阳性神经元大量表达〔3〕。针灸预处理能够启动机体自身的防御机制，抵御未发生但可能发生的疾病或损伤〔4～7〕。针灸预处理足三里穴可有效抑制c-fos在甲醛注射大鼠脊髓第4腰髓(L4)至第5腰髓(L5)节段的表达〔8〕，c-fos的表达水平可以作为评估超前镇痛效果的指标。本实验选取足三里穴进行针灸预处理，采用足底甲醛致痛模型，观察成年和老年大鼠对炎症性疼痛反应的差别及针灸预处理对成年和老年大鼠脊髓NO分布和c-fos表达的影响。

1材料和方法

1.1实验动物和分组4月龄〔n=24，体重(350±50)g〕和21月龄〔n=24，体重(500±50)g〕雄性SD大鼠分别随机分为四组：4月龄对照组(CTL-1，不做任何处理)，4月龄甲醛组(For-1，仅注射甲醛)，4月龄针灸足三里穴+甲醛组(ST36+For-1，针灸足三里穴后注射甲醛)，4月龄针灸非穴位+甲醛组(NA+For-1，针灸非穴位后注射甲醛)；21月龄对照组(CTL-2)，21月龄甲醛组(For-2)，21月龄针灸足三里穴+甲醛组(ST36+For-2)和21月龄针灸非穴位+甲醛组(NA+For-2)，每组6只。所有动物均购自辽宁医学院动物管理基地，动物实验得到辽宁医学院动物管理委员会的许可。

1.2实验方法

1.2.1针灸操作采用一次性无菌针灸针进行针灸操作。足三里穴定位在胫骨和腓骨之间，约胫骨前嵴外5 mm和下5 mm的交界处〔9〕。髂嵴上10～15 mm、后正中线旁开20 mm区段内确定一固定对照点作为非穴位点〔10〕。在乙醚吸入麻醉下，分别针灸右侧足三里穴及非穴位点。对照组和甲醛注射组与其他针灸组做相同时间吸入麻醉的处理，以确保相同的实验条件。针灸针刺入穴位后，每秒钟按顺、逆时针方向捻转针体2次，如此行针1 min、留针9 min为1个周期，重复4个周期，共计40 min〔11〕。最后9 min，停止吸入麻醉使大鼠苏醒，针灸针的插入深度约为4～5 mm。针灸预处理每日一次，连续7 d。

1.2.2甲醛注射和行为学观察最后一次针灸预处理后，待动物完全苏醒，除了对照组，其余各组动物均在右后足底皮下注射100 μl 5%的甲醛，对照组不做任何处理。甲醛注射后，将大鼠置于透明玻璃罩中，通过视频捕捉系统记录注射甲醛溶液后1 h内大鼠注射足的回缩次数和舔(咬)足时间(s)，每5 min统计一次，用来评估大鼠疼痛的程度。

1.2.3灌流取材甲醛注射1.5 h后，在10%水合氯醛深麻下灌流固定(0.4 ml/100 g，腹腔注射)，取出脊髓L4～L5节段，于4%多聚甲醛溶液中后固定。冰冻切片40 μm，将切片分为三部分，分别进行NADPH-d组织化学染色、c-fos免疫组织化学染色和NADPH-d/Fos双标染色。

1.2.4NADPH-d组织化学法染色切片于含0.2% TritonX-100的Tris缓冲液中室温下孵育5～10 min，然后在含有0.3% TritonX-100、1 mg/ml NADPH和0.5 mg/ml NBT的Tris缓冲液中，37℃ 孵育1～1.5 h。Tris缓冲液漂洗终止反应。

1.2.5c-fos免疫组织化学染色将各组切片置于溶于甲醇溶液的0.3%过氧化氢溶液中处理30 min，以消耗内源性的过氧化物酶。2%的正常山羊血清溶液中室温封闭2 h后置于兔多克隆抗c-fos抗体(1∶8 000，Abcam)中室温孵育48 h(加入0.1%的叠氮钠)。于生物素化山羊抗兔IgG溶液(1∶1 000，Vector Lab)中室温孵育2 h后，在链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶溶液(1∶1 000，Vector Lab)中室温孵育1.5 h。最后，在含0.02%二氨基联苯胺(DAB)和0.004%过氧化氢的0.05 mol/L的Tris缓冲液(pH 7.4)中室温显色15 min。Tris缓冲液漂洗终止反应。

1.2.6NADPH-d/Fos双标染色切片进行NADPH-d组织化学染色后再进行c-fos免疫组织化学染色(方法同上)。终止反应后将切片裱在明胶包被的载玻片上，干燥，脱水，透明，封片。

2结果

2.1行为学检测甲醛注射后，大鼠呈典型的双向伤害性行为反应，即注射后即刻出现约5 min的急性疼痛时相，后5 min减弱；约从10～60 min内出现继发性疼痛。①急性疼痛时相(0～10 min)：4月龄和21月龄大鼠的缩足次数和舔(咬)足时间在甲醛组、针灸足三里穴+甲醛组、针灸非穴位+甲醛组之间没有统计学差异(P>0.05)。②继发性疼痛时相(10～60 min)：甲醛组21月龄大鼠的缩足次数高于4月龄大鼠(P<0.05)，舔(咬)足时间与4月龄比较无差异(P>0.05，图1B)；针灸足三里穴+甲醛组4月龄大鼠的缩足次数(P<0.01)和舔(咬)足时间(P<0.05)低于甲醛组，21月龄大鼠的缩足次数和舔(咬)足时间低于甲醛组(P<0.01)；4月龄和21月龄大鼠针灸非穴位+甲醛组与甲醛组之间比较无统计学差异(P>0.05)。见表1。

2.2NADPH-d组织化学法染色NADPH-d阳性神经元呈蓝色深染，主要分布在甲醛注射侧脊髓背角(DH，图2A)和中央管(CC，图2B)附近。结果显示，对照组中，NADPH-d阳性神经元的基础水平较低，且21月龄大鼠DH的NADPH-d阳性神经元数量低于4月龄大鼠(P<0.01)。与对照组比较，其他各组大鼠DH(P<0.01)和CC(P<0.01)附近的NADPH-d阳性神经元数量均高于对照组。甲醛组中，21月龄大鼠NADPH-d阳性神经元数量高于4月龄大鼠(P<0.05，P<0.01)。与甲醛组比较，4月龄和21月龄大鼠针灸足三里穴+甲醛组DH的NADPH-d阳性神经元数量均下降(P<0.01)，而脊髓CC附近的NADPH-d阳性神经元数量无变化(P>0.05)。4月龄和21月龄大鼠针灸非穴位+甲醛组的NADPH-d阳性神经元数量与甲醛组比较无差异(P>0.05)。见表2。

表1　各组行为学检测结果统计表±s,n=6)

与For-1组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与For-2组比较:3)P<0.01

表2　各组阳性神经元数

与CTL-1组比较：1)P<0.01；与CTL-2组比较：2)P<0.01；与For-1组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与For-2组比较：5)P<0.01

A′、B′分别为A、B中方块内的放大图片；下图同图2　NADPH-d组织化学法染色结果

2.3Fos免疫组织化学法染色对照组中，Fos免疫阳性神经元的基础水平较低，且在4月龄和21月龄大鼠脊髓中没有统计学差异(P>0.05)。与对照组大鼠比较，其他各组大鼠脊髓Fos免疫阳性神经元的表达均增加(P<0.01)。甲醛组中，21月龄大鼠的Fos免疫阳性神经元数高于4月龄大鼠(P<0.01)。与甲醛组比较，4月龄和21月龄大鼠针灸足三里穴+甲醛组的Fos免疫阳性神经元数均下降(P<0.01)，而针灸非穴位+甲醛组Fos免疫阳性神经元无变化(P>0.05)。见图3，表2。

图3　Fos免疫组织化学法染色结果

2.4NADPH-d/Fos双标染色4月龄和21月龄大鼠对照组均未发现NADPH-d/Fos双标的阳性神经元，其余各组均在DH发现NADPH-d/Fos双标的阳性神经元，而在脊髓CC附近没有。甲醛组中，4月龄和21月龄大鼠脊髓NADPH-d/Fos双标阳性神经元数量无差异(P>0.05)。与甲醛组比较，4月龄和21月龄大鼠针灸足三里穴+甲醛组的NADPH-d/Fos双标阳性神经元数量均下降(P<0.01)。4月龄和21月龄大鼠针灸非穴位+甲醛组的NADPH-d/Fos双标阳性神经元数量与甲醛组比较无差异(P>0.05)。见图4，表2。

图4　NADPH-d/Fos双标染色结果

2.5甲醛组与针灸足三里穴+甲醛组的差值分别统计4月龄和21月龄大鼠甲醛组(For组)与针灸足三里穴+甲醛组(ST36+For组)的NADPH-d阳性神经元、Fos免疫阳性神经元和NADPH-d/Fos双标阳性神经元数量的差值，结果显示，21月龄大鼠的NADPH-d阳性神经元(10.05±1.59)、Fos免疫阳性神经元数量(50.47±2.67)在For组和ST36+For组之间的差值均高于4月龄大鼠(4.85±1.15,29.97±1.85)(P<0.01)，而NADPH-d/Fos双标阳性神经元数量的差值在4月龄(2.18±0.55)和21月龄(1.07±0.30)大鼠间无差异(P>0.05)。

3讨论

足三里穴的躯体传入神经投射到脊髓L4～L5节段〔12〕。足底甲醛注射后，大鼠呈典型的双向伤害性行为反应，急性疼痛反应是由于外周的直接刺激引起，而继发性疼痛反应则涉及中枢神经系统的参与。本实验显示，继发性疼痛时相甲醛组老年大鼠的缩足次数高于成年大鼠，表明老年大鼠对炎症性疼痛的反应较成年大鼠更敏感。针灸预处理足三里穴减少了大鼠继发性疼痛时相注射足的缩足次数和舔(咬)足时间，这说明针灸预处理足三里穴减轻了大鼠的疼痛反应，提高了疼痛阈值。

NO作为重要的神经调节因子，其产生异常影响着衰老的进程〔13〕。适量NO具有明显的神经保护作用，但过量的NO则会对神经元产生毒性。正常成年脊髓存在NOS能神经元，NO参与脊髓疼痛信号的传递，抑制NO的生成具有显著的抗疼痛作用。本研究证实，老年大鼠脊髓NO的基础水平低于成年大鼠，这与衰老后机体的免疫力下降、功能减退相符。足底甲醛刺激后，DH和CC附近NO的数量增加，且在老年大鼠的含量高于成年大鼠。DH和CC附近是感受疼痛的主要区域，针灸预处理足三里穴后，DH的NO含量下降，且老年大鼠的下降幅度高于成年大鼠，这可能与足三里穴的躯体传入神经纤维上行投射至脊髓L4～L5节段背角有关。以上结果表明，衰老大鼠对疼痛反应更为敏感，且针灸处理对衰老大鼠的镇痛作用强于成年大鼠。NO可作为第二信使诱导c-fos表达，NO通过激活c-fos的表达影响感受疼痛神经元的中枢敏化作用，释放其他的多肽和氨基酸，从而调控神经元活性。c-fos表达作为躯体和内脏伤害性刺激引起中枢神经系统神经元激活的标志，被认为是神经系统功能的一种特殊标记〔14〕。近年研究报道，疼痛信号随年龄的变化而改变。与青年和成年大鼠比较，c-fos在新生大鼠DH浅层、深层和腹角的表达显著增加〔15〕。在甲醛注射后的中老年大鼠脑中Fos 免疫阳性神经元表达的数量显著高于青年大鼠〔16〕。在某些方面，中年小鼠对内毒素暴露比年轻小鼠更为敏感，且在大脑中显现出增强的c-fos表达〔17〕，c-fos mRNA的转录在老年大鼠背侧海马的椎体细胞和颗粒细胞中发生改变〔18〕。然而，关于疼痛信号在老年脊髓的变化及针灸预处理在老年领域的研究还很匮乏。本实验结果证实，正常情况下脊髓c-fos表达的基础水平较低，足底甲醛刺激后，大量Fos蛋白在脊髓L4～L5节段DH浅层表达，且在老年大鼠的表达高于成年大鼠。针灸预处理足三里穴降低了c-fos在脊髓的表达，且老年大鼠的下降幅度高于成年大鼠，这与NO数量变化结果一致。此外，本实验发现，在对照组中没有NADPH-d/Fos双标阳性神经元；甲醛注射后，NADPH-d/Fos双标阳性神经元在DH出现，CC附近没有，且在老年大鼠与成年大鼠间无差异。针灸预处理足三里穴降低了DH的NADPH-d/Fos双标阳性神经元数量。

综上研究结果，老年大鼠对炎症性疼痛的反应强于成年大鼠。针灸预处理足三里穴可以减轻大鼠疼痛反应，降低脊髓NO的数量和c-fos的表达，具有超前镇痛的效果。然而，针灸预处理足三里穴后，老年大鼠脊髓NO和Fos蛋白下降的数量高于成年大鼠，但是NADPH-d/Fos双标阳性神经元下降的数量在老年大鼠和成年大鼠间无差异。由此我们推测，针灸预处理的镇痛作用在成年和老年大鼠之间可能涉及不同信号通路的参与，这将为衰老相关机制的研究提供新的线索。

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〔2015-12-07修回〕

(编辑李相军)

基金项目：国家自然科学基金面上项目(81471286)

通讯作者：谭会兵(1963-)，男，教授，硕士生导师，主要从事老年腰骶脊髓研究。

〔中图分类号〕R2-031

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)13-3101-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.005

Effects of acupuncture preconditioning on NO distribution and c-fos expression in spinal cord of adult and aged rats with formalin-induced pain

SONG Ya-Guang, WEI Zi-Chun, WANG Yu,et al.

Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, Liaoning, China

【Abstract】ObjectiveTo compare the difference of the response to inflammatory pain of adult and aged rats, and the effects of acupuncture preconditioning (AP) on nitric oxide (NO) distribution and c-fos expression in the spinal cord of adult and aged rats with formalin injection.MethodsThe 4 and 21 months old male SD rats were randomly divided into control (CTL, with nothing treated), formalin-injection-only group (For), formalin injection following AP at the acupoint ST36 group (ST36+For) and formalin injection following AP at a non-acupoint groups (NA+For) respectively. The behavioral responses of rats were observed, and the flinching number and licking time in 1 hour after formalin injection were recorded. The segment of 4th lumbar spinal cord to 5th lumbar spinal cord was obtained 1.5 hours after formalin injected. The distribution of NO and the Fos-immunoreactive (Fos-ir) neurons were detected by enzyme histochemical and immunohistochemical techniques.ResultsIn control group, the number of NO of aged rats was lower than that of adult rats(P<0.01); there were no double labeled neurons of NO and Fos in adult and aged rats. In formalin-injection-only groups: the flinching number in the late phase was higher in aged rats than that in adult ones (P<0.05). Compared to those of control groups, the number of NO positive neuron was increased, Fos positive neurons and double labeled neurons of NO and Fos were observed in the spinal cord of both adult and aged rats (P<0.01). The number of NO positive neuron (P<0.05, P<0.01) and Fos positive neurons (P<0.01) were higher in aged rats than those in adult ones. In formalin injection following AP at the acupoint ST36 groups, the flinching number (P<0.01) and licking time (P<0.05,P<0.01) in the late phase of adult and aged rats were lower than those of formalin-injection-only groups. The number of NO positive neuron, Fos positive neuron and double labeled neuron of NO and Fos in adult and aged rats were both lower than those of formalin-injection-only groups(P<0.01). Compared to those of formalin-injection-only groups, the range of decline of the number of NO positive neuron and Fos positive neuron were higher in aged rats than those in adult ones(P<0.01). ConclusionsAP at the acupoint ST36 could improve the pain threshold, relieve the pain reaction, and reduce the number of NO and the expression of c-fos in spinal cord which with more potential in aged rats.

【Key words】Acupuncture preconditioning; Aging;Nitric oxide(NO);c-fos

1锦州医科大学附属第三医院

霍博雅(1960-)，女，教授，硕士生导师，主要从事中西医结合抗衰老的研究。

第一作者：宋亚光(1991-)，女，硕士，主要从事中西医结合抗衰老研究。