陈明明，潘小霞，郑法文，陈丽容，李燕婧，范建华，韦立富（.南宁市中西医结合医院，南宁 500；.南宁市第一人民医院，南宁 500；.广西中医药研究院，南宁500）



·动物实验·

朱琏针刺兴奋法对缺血缺氧性脑损伤幼鼠神经细胞凋亡和PI3K、AKt、Caspase-3蛋白表达的影响

陈明明1，潘小霞1，郑法文2，陈丽容1，李燕婧3，范建华3，韦立富1
（1.南宁市中西医结合医院，南宁 530012；2.南宁市第一人民医院，南宁 530021；3.广西中医药研究院，南宁530022）

【摘要】目的观察朱琏针刺兴奋法不同时机介入对缺血缺氧性脑损伤幼鼠神经细胞凋亡和组织PI3K（phosphatedylinositol 3-kinase）、AKt（Serine/threonine kinase）、Caspase-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3）蛋白表达的影响。方法将50只7日龄大鼠随机分为A组（兴奋法针刺Ⅰ组）、B组（兴奋法针刺Ⅱ组）、C组（模型组）、D组（假手术组）和E组（正常对照组），每组10只。A组和E组从造模24 h内开始针刺；B组从造模第8天开始针刺；C组和D组不做针刺处理。各组动物于造模后的第21天处死，采用原位末端标记（TUNEL）技术检测脑神经细胞凋亡，采用免疫组化法测定脑组织PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表达。结果A组和B组凋亡细胞数明显少于C组（P＜0.01，P＜0.05）；与B组比较，A组凋亡细胞数明显减少（P＜0.05）。与C组比较，A组和B组PI3K、Akt蛋白表达明显增高，Caspase-3蛋白表达明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。与B组比较，A组PI3K表达明显增高，Caspase-3蛋白表达明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论朱琏针刺兴奋法具有抑制缺血缺氧性脑损伤幼鼠神经细胞凋亡，能刺激PI3K/Akt信号通路的表达，增强PI3K、AKt活性，降低Caspase-3蛋白表达的作用。且早期介入朱琏针刺兴奋法，对缺血缺氧性脑损伤幼鼠的脑神经保护作用意义重大。

【关键词】针刺疗法；朱琏针刺兴奋法；脑损伤；幼鼠；细胞凋亡；PI3K；AKt；Caspase-3

小儿脑性瘫痪（cerebral palsy，CP）又称脑瘫，是小儿出生前到出生后1个月内因各种原因所引起的脑损伤或发育缺陷所致的运动障碍及姿势异常，常伴有智力低下、癫痫、语言障碍等［1］，临床上缺血缺氧性脑损伤（hypoxia-ischemia brain damage，HIBD）是引起新生儿CP的主要原因。凋亡是脑缺血的神经细胞损伤的重要机制之一。近年来研究［2］表明，PI3K/Akt信号通路是缺血再灌注后引起细胞凋亡、氧化应激等过程的重要信号通路。而Caspase-3蛋白在各种因素启动的凋亡程序中起重要的枢纽作用。本实验研究采用原位末端标记（TUNEL）技术和免疫组化法，观察朱琏针刺兴奋法在不同时机介入对缺血缺氧性脑损伤幼鼠神经细胞凋亡数及PI3K、AKt、Caspase-3蛋白表达的影响，探讨朱琏针刺兴奋法治疗CP的可能作用机制，为有效治疗CP提供科学依据。

1　材料与方法

1.1实验动物与分组

选用7日龄新生SD大鼠50只，雌雄各半，体重为12～14 g，SPF级，动物由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号SCXK桂2009-0002）。根据幼鼠体重随机分为A组（兴奋法针刺Ⅰ组）、B组（兴奋法针刺Ⅱ组）、C组（模型组）、D组（假手术组）和E组（正常对照组），每组10只。A组、B组和E组进行朱琏针刺兴奋法一型处理，C组和D组不作针刺处理。5组喂养方式、生活环境相同。

1.2主要仪器及试剂

Image master图像分析仪（美国 Pharmacia Bioten公司）；LeicaCM1950冷冻切片机（德国莱卡公司）；双目光学显微镜（日本Olympus公司）；华佗牌0.25 mm×25 mm一次性无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司）。TUNEL细胞凋亡，PI3K、Akt、Caspase-3兔抗大鼠多克隆试剂盒（Santa Cruz公司）；DAB染液（武汉博士德生物公司）。

1.3动物模型制备及干预措施

1.3.1动物模型制备［3］

幼鼠在乙醚吸入浅麻醉状态下，切开颈部皮肤，分离左颈总动脉并结扎，缝合切口，术后返回母鼠笼中，恢复2 h后，置于37℃恒温水浴的密闭容器中，以1 L/min的速度通入低氧气体（体积浓度为8%的氧气和92%的氮气），2.5 h后将动物取出，继续保温1 h后作行为测定，翻身不能、平衡异常和左旋者视为成功的模型，并返回母鼠笼中饲养。D组麻醉后切开颈部皮肤，分离左颈总动脉后不结扎，缝合切口后亦不作低氧处理，行为测定均无异常。E组不做任何处理。

1.3.2取穴定位

根据《实验针灸学》［4］，大鼠穴位图谱定位，选取水沟（唇裂鼻尖下1 mm正中处）、百会（顶骨正中）、大椎（第7颈椎与第1胸椎间，背部正中）、曲池（桡骨近端的关节外侧前方的凹陷中取）、合谷（前肢第1、第2掌骨之间）、内关（前肢内侧，离腕关节约3 mm的尺桡骨缝间）、足三里（即后三里，在膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处）、昆仑（即跟端，后肢外踝与跟腱之间的凹陷中）、太冲（后肢外踝正下方凹陷中）、涌泉（后肢掌心前正中取）。

1.3.3针刺方法

穴位处皮肤常规消毒后，行朱琏针刺兴奋法一型手法［5］，即采用快速刺入法进针，然后迅速短暂地提插浅刺3次，不留针，迅速抖出法起针。按照水沟、百会、大椎、曲池、合谷、内关、足三里、昆仑、太冲、涌泉的顺序针刺。A组和E组从造模24 h内开始针刺，自上而下，从左到右。每日1次，间隔24 h后重复进行，连续5 d为1个疗程，共治疗3个疗程，疗程间休息2 d。B组从造模后第8天开始针刺，取穴和针刺方法同A组，共治疗2个疗程。C组和E组只予固定，不予针刺。所有实验幼鼠于造模第21天处死、取脑。针刺操作者需经朱琏针灸手法师承培训并临床实际操作1年以上，并取得中级以上职称。

1.4标本处理与观察指标

1.4.1脑组织采集和固定

采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，打开胸腔，暴露心脏，从左心部插入导管至主动脉，松开双侧止血夹，立即用0.01 mol/L PBS液及4%多聚甲醛对大鼠进行在体灌注，直至大鼠心、肝肺颜色变浅变白，四肢僵硬，然后迅速断头，取脑，除去小脑、脑干及嗅球，取左侧半球，冠状面切开，然后用4%甲醛溶液（PFA）中固定24 h。

1.4.2神经细胞凋亡的测定

取4%PFA固定的脑组织，冰冻切片厚度为5 mm，常规脱水，石蜡包埋。切片，厚度为2m，采用原位末端标记（TUNEL）技术，用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行操作，在荧光显微镜下用蓝色激发光照射，在高倍镜下在皮质、纹状体、海马区随机各取5个视野计数发出黄绿色荧光的阳性细胞。

1.4.3PI3K、Akt、Caspse-3表达的测定

取4%PFA固定的脑组织，常规脱水，石蜡包埋并切片备用，切片厚4m，然后行常规脱蜡水化，阻断内源性过氧化物酶、枸橼盐酸缓冲液微波法抗原修复。水洗后，分别加入兔抗大鼠PI3-K、AKt、Caspase-3一抗，漂洗，加二抗，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。在显微镜下观察，用Image master图像分析仪测量各组大鼠脑皮质区PI3K、AKt、Caspase-3蛋白表达的阳性细胞吸光度。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5统计学方法

实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，数据统计采用SPSSl3.0软件进行分析处理。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2　结果

2.1各组幼鼠脑凋亡阳性细胞数比较

E组脑组织切片仅观察到散在分布的少量凋亡细胞，C组凋亡细胞数较E组显著增多（P＜0.05）。与E组比较，A组和B组凋亡细胞数均显著增多（P＜0.05），提示针刺后脑细胞凋亡情况仍然存在，未能达到正常水平；但与C组比较，A组和B组凋亡细胞数均显著降低（P＜0.01，P＜0.05），提示朱琏针刺兴奋法能抑制缺血缺氧性脑损伤幼鼠脑神经细胞凋亡。A组凋亡细胞数较B组显著降低（P＜0.05），提示朱琏针刺兴奋法早期介入能较明显地抑制缺血缺氧性脑损伤幼鼠脑神经细胞凋亡。详见表1、图1。

表1　各组幼鼠脑凋亡阳性细胞数比较　（±s）

表1　各组幼鼠脑凋亡阳性细胞数比较　（±s）

注：与E组比较1）P＜0.01；与C组比较2）P＜0.01，3）P＜0.05；与A组比较4）P＜0.05

组别　例数　皮质区　纹状体区　海马区A组　10　3.50±1.43　4.70±2.71　3.20±2.04 B组　10　4.10±2.02　5.40±2.22　3.50±1.58 C组　10　16.80±4.391）　14.50±2.881）　12.30±2.631）D组　10　10.10±1.791）3）　9.50±2.171）3）　9.50±1.721）2）E组　10　13.00±3.531）2）4）　11.8±1.931）2）4）　10.80±1.811）

2.2各组幼鼠脑组织PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表达比较

与E组比较，C组PI3K、Akt蛋白表达明显减少，Caspase-3蛋白表达明显增加，两组比较差异均具有统计学意义（P＜0.01）；与E组比较，A组和B组PI3K、Akt蛋白表达明显减少，Caspase-3蛋白表达明显增加，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。但与C组比较，A组和 B组 PI3K、Akt蛋白表达明显增高，Caspase-3蛋白表达明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），提示朱琏针刺兴奋法能上调缺血缺氧性脑损伤幼鼠PI3K、Akt，下调Caspse-3蛋白的表达。A组PI3K蛋白表达较B组明显增高，Caspase-3蛋白表达明显降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05），提示朱琏针刺兴奋法早期介入能明显上调缺血缺氧性脑损伤幼鼠PI3K，下调Caspase-3蛋白的表达。详见表2、图2。

表2　各组幼鼠脑组织PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表达的比较　（±s,ug/L）

表2　各组幼鼠脑组织PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表达的比较　（±s,ug/L）

注：与E组比较1）P＜0.01，2）P＜0.05；与C组比较3）P＜0.01，4）P＜0.05；与A组比较5）P＜0.05

组别　例数　PI3K　Akt　Casapase-3 A组　10　11.88±2.16　9.52±1.35　0.18±0.54 B组　10　10.77±2.71　9.37±1.49　0.23±0.06 C组　10　6.76±1.651）　6.21±1.191）　0.61±0.131）D组　10　9.37±1.261）4）　7.89±1.372）3）　0.39±0.101）4）E组　10　8.16±1.271）3）5）　8.21±1.744）　0.51±0.101）5）

图2　各组幼鼠PI3K、Akt、Caspase-3蛋白表达（免疫组化）

3　讨论

朱琏是现当代著名针灸学家［6］，其在学术上建立了一套基于现代神经科学的“新针灸学”理论体系，提出针灸治病的3个关键因素，即刺激的手法（兴奋法和抑制法）、刺激的部位（穴位）和刺激的时机（择时、疗程）。其中，针刺兴奋法是针对身体机能处于过度抑制或衰退状态者，如休克、瘫痪、麻痹、感觉减退或丧失、精神运动过度抑制等病症，可起到促进生理机能，解除过度抑制，唤起正常兴奋的作用。手法要求取穴较多、刺激量不大、时间短暂（不留针）及患者感觉较轻。本法能使机体产生多个兴奋点传导，冲击大脑皮层，从而打破大脑皮层的超限制抑制，唤起正常的兴奋功能，达到治疗疾病目的［7］。但其作用机制并不十分明确。

PI3K是一种磷脂酰肌醇激酶，以磷酸化肌醇环第三位羟为其功能特点。PI3K激活后可磷酸化细胞膜上的肌醇，产生第二信使PIP3，PIP3通过与Akt的PH结构域结合，引发Akt从细胞质转位到细胞膜并促使其构象发生改变，进而磷酸化Akt的Thr308和Ser473位点使Akt被活化。Akt又名蛋白激B（PKB），是分子量约为60 kD的丝/苏氨酸蛋白激酶，是重要的抗凋亡调节因子。P13K/Akt信号通路是细胞存活密切相关的重要信号通路，神经保护作用与激活P13K/Akt信号通路相关［8］。研究发现，大脑中动脉栓塞大鼠梗死中心区仅有微量的PI3K、AKt表达，而在缺血灶周围则有大量PI3K及磷酸化的AKt表达，证明PI3K/AKt信号通路不仅参与了脑缺血的病理生理过程，而且与脑损伤的程度密切相关［9］。caspase是一组天门冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶（cysteinpmlease），caspase家族是一大类凋亡调节基因，是哺乳动物细胞凋亡的启动和执行者，而caspase-3是caspase家族中最重要的凋亡执行者之一。caspase-3是多种凋亡途径最主要的下游效应因子之一，是细胞凋亡公认的关键酶。进一步研究发现，在缺血性神经损伤过程中，抑制caspase-3活性可产生明显的神经保护作用［10］。

本实验结果表明，缺血缺氧性脑损伤幼鼠脑组织PI3K及AKt表达较D组及E组明显降低，Caspase-3表达及神经细胞凋亡数量明显增加。朱琏针刺兴奋法针刺干预后各项指标虽未达正常水平，但较C组已有显著改善，提示朱琏针刺兴奋法针刺干预不仅能下调缺血缺氧性脑损伤幼鼠Caspase-3表达，而且能提高PI3K及AKt活性，抑制神经细胞凋亡，改善脑神经功能，且早期介入作用更明显。由此可见，朱琏针刺兴奋法对缺血缺氧性脑损伤幼鼠的神经保护作用的主要机制可能是通过激活幼鼠脑组织的PI3K/AKt信号通路，抑制Caspase-3蛋白表达，从而抑制细胞凋亡，促进神经细胞的功能代谢，重建神经元网络。

参考文献

［1］中华医学会儿科学分会神经学组.小儿脑性瘫痪的定义、诊断条件及分型［J］.中华儿科杂志，2005，43（4）：262.

［2］Kamada H，Nito C，Endo H，et al.Bad as a converging signaling molecule between survival PI3-K/Akt and death JNK in neurons after transient focal cerebral ischemia in rats［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27（3）：521-533.

［3］Holtzman DM，Shelodon RA，Jaffe W，et al.Nerve growth factor protects the neonatal brain against hypoxic-ischemic injury［J］.Ann Neurol，1996，39（1）：114-122.

［4］张露芬.实验针灸学［M］.北京：化学工业出版社出，2010：219.

［5］朱琏.新针灸学［M］.南宁：广西人民出版社，1980：17.

［6］韦立富，潘小霞，刘兵，等.朱琏针灸临床特色与经验［J］.中国针灸，2015，35（1）：94-97.

［7］韦立富，岳进，潘小霞.现代针灸学家朱琏学术思想简介［J］.中国针灸，2008，28（9）：667-671.

［8］聂莹雪，刘华岩，翟志勇.大鼠脑缺血再灌注后海马组织PI3-K信号通路的变化［J］.中国老年学杂志，2007，27（10）：943-944

［9］许艺超，石松生.PI3K/AKt信号通路在脑缺血神经元凋亡中作用的研究进展［J］.国际神经病学神经外科杂志，2012，39（6）：530-533.

［10］Kitagawa H，Warita H，Sasaki C，et al.Immunoreactive Akt，PI3-K andERKproteinkinaseexpressioninischemicratbrain［J］. Neurosci Lett，1999，274（1）：45-48.

【中图分类号】R2-03

【文献标志码】A

DOI：10.13460/j.issn.1005-0957.2016.05.0592

文章编号：1005-0957（2016）05-0592-04

收稿日期2016-01-11

基金项目：广西卫计委中医药科技专项公关课题（GZGG13-11）

作者简介：陈明明（1984-），女，主治医师

通信作者：潘小霞（1964-），女，主任医师，Email：echenpxx@163.com

Effect of Zhu Lian Acupuncture Exciting Method on Nerve Cell Apoptosis and the Expressions of PI3K，AKt and Caspase-3 Proteins in Young Rats with Hypoxic-ischemic Brain Damage

CHEN Ming-ming1，PAN Xiao-xia1，ZHENG Fa-wen2，CHEN Li-rong1，LI Yan-jing3，FAN Jian-hua3，WEI Li-fu1.
1.Nanning Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine，Nanning 530012，China；2.Nanning First People's Hospital，Nanning 530021，China；3.Guangxi Academy of Traditional Chinese Medicine，Nanning 530022，China

［Abstract］ObjectiveTo investigate the effect of different time intervention of Zhu Lian acupuncture exciting method on nerve cell apoptosis and tissue expressions of PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase），AKt（serine/threonine kinase）and Caspase-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3）proteins in young rats with hypoxic-ischemic brain damage.MethodsFifty 7-day-old rats were randomized into groups A（acupuncture exciting methodⅠ），B（acupuncture exciting methodⅡ），C（model），D（sham operation）and E（normal control），10 rats each.Groups A and E began to receive acupuncture in 24 hours after model making and group B，at 8 days after model making.Groups C and D were not given acupuncture.Every group of animals was sacrificed at 21 days after model making.Nerve cell apoptosis was examined using In situ end labeling（TUNEL）technique.Cerebral expressions of PI3K，AKt and Caspase-3 proteins were determined by immunohistochemical method.ResultsThe number of apoptotic cells was significantly smaller in groups A and B than in group C（P＜0.01，P＜0.05）and decreased significantly in group A compared with group B（P＜0.05）.The expressions of PI3K and AKt proteins increased significantly and the expression of Caspase-3 protein decreased significantly in groups A and B compared with group C；there were statistically significant differences（P＜0.01，P＜0.05）. PI3K expression increased significantly and Caspase-3 protein expression decreased significantly in group A compared with group B （P＜0.05）；there were statistically significant differences（P＜0.05）.ConclusionsZhu Lian acupuncture exciting method can inhibit nerve cell apoptosis，stimulate the expression of PI3K/AKt signaling pathway，increase PI3K and AKt activities and reduce the expression of Caspase-3 protein in young rats with hypoxic-ischemic brain damage.Early intervention of Zhu Lian acupuncture exciting method is of important significance in producing a protective effect on brain nerves in young rats with hypoxic-ischemic brain damage.

［Key words］Acupuncture therapy；Zhu Lian acupuncture exciting method；Brain damage；Young rats；Apoptosis；PI3K；AKt；Caspase-3